Sane mangkin†Alamat sane mangkin: OX11 0DE, Inggris, Gedung Berlian, Taman Sains lan Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Sumber Cahaya Berlian Co., Ltd., Pusat Pencitraan Biologis Elektronik.
Pusat reaksi kompleks panen cahaya 1 (RC-LH1) inggih punika komponen fotosintesis inti bakteri fototrofik ungu. Iraga nyobyahang kalih struktur mikroskop krio-elektron saking kompleks RC-LH1 saking Rhodopseudomonas palustris. Struktur resolusi 2,65-Å kompleks RC-LH114-W kawangun antuk 14 subunit loop LH1 sane ngiterin RC, sane kaganggu olih protein W, nanging kompleks sane nenten madue protein-W jangkep komposisi RC sane ngiterin RC. Katutup 16 subunit lingkaran LH1. Perbandingan struktur puniki ngicenin wawasan indik dinamika kinon ring kompleks RC-LH1, rumasuk pauwahan konformasi sadurungnyane nenten katentuang rikala ngiket kinon ring situs RC QB, taler genah situs pengikat kinon bantu, sane ngwantu Pass ipun ka RC. Struktur unik protein W ngawinang penutupan loop LH1, punika ngawinang saluran anggen ngelisang pertukaran kinon/kinolon.
Energi sané kasayagayang olih fotosintesis prasida ngamit makasami kahuripan ring jagaté, miwah madué potensi sané ageng ring bioteknologi surya. Rikalaning ngalimbakang fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu taler nyihnayang makudang-kudang mode energi miwah kawagedan metabolisme. Ipun prasida ngelidin fotosintesis lan mentik dados bakteri heterotrofik ring peteng, prasida mecikang nitrogen lan karbondioksida, ngasilang hidrogen, lan ngrusak senyawa aromatik (1-3). Mangda prasida ngicenin energi majeng ring proses-proses punika, cahaya mangda gelis lan efisien kauwah dados energi kimia. Proses puniki kakawitin ritatkala kompleks antena penjebak cahaya nyerep cahaya lan mentransfer energi sane terjebak ke pusat reaksi (RC), antuk punika ngawitin pemisahan muatan (4 – 7). Unit dasar fotosintesis ring bakteri fototrofik ungu kawangun antuk tipe 2 RC, sané kaiterin olih kompleks panen cahaya 1 (LH1), ngwentuk kompleks inti RC-LH1. LH1 kawentuk olih makudang-kudang heterodimer αβ sané melengkung, soang-soang ngiket kalih molekul klorofil bakteri (BChl) miwah asiki utawi kalih karotenoid (8-12). Antena LH1 sane pinih sederana kawangun antuk 16 utawi 17 heterodimer αβ sane ngiterin RC (9-13) ring loop sane matutup, nanging ring kompleks inti sane lianan, peptida transmembran ngrusak kontinuitas LH1 sane ngiterin , Antuk punika ngalimbakang difusi kinol/kinon lan sitok1, bRC1, 13-15). Entik-entikan fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) inggih punika organisme model sané prasida ngresepang energi miwah pamargin elektron sané nyokong fotosintesis. Struktur kristal sane kapertama inggih punika Rps. Model kompleks RC-LH1 palustris inggih punika RC, sane kaiterin olih 15 loop LH1 heterodimer, sane kaganggu olih protein sane nenten kauningin sane mawasta “Protein W” (14). Protein-W raris kaidentifikasi pinaka RPA4402, sané marupa protein 10,5 kDa sané nénten madué ciri antuk tiga heliks transmembran (TMH) sané katarka (16). Iraga ngusulang mangda ngalih wastan gen rpa4402 sane nyiriang protein W dados pufW mangda prasida anut sareng wastan sane kawigunayang anggen gen sane nyiriang subunit RC-L, M (pufL, pufM) miwah LH1α, β (pufA, pufB). Sane menarik, protein-W wantah wenten ring sawatara 10% saking RC-LH1, ngungkapang Rps. palustris ngasilang kalih kompleks RC-LH1 sane matiosan. Iriki, iraga nglaporang struktur krio-EM (krio-EM) resolusi tinggi saking kalih kompleks inti, asiki antuk protein W lan 14 heterodimer αβ, sane lianan tanpa protein W lan loop LH1 16 Heterodimer sane matutup. Struktur iraga ngangganin pauwahan langkah ring pangresepan kompleks RC-LH1 saking Rps. palustris, santukan iraga sampun nganalisis populasi homogen saking soang-soang varian lan madue resolusi sane cukup anggen jelas netepang soang-soang peptida lan pigmen sane kaiket lan lipid lan kinon sane mapaiketan. Perbandingan struktur puniki nyihnayang indik tiga protein TMH-W sane durung kapanggihin ring kompleks RC-LH1 sane lianan kantos mangkin ngasilang saluran kinon anggen ngelisang pertukaran kinon/kinolon. Makudang-kudang genah ngiket lipid miwah kinon sané kakonservasi sampun kaidentifikasi, miwah iraga sampun nyihnayang pauwahan konformasi anyar risampuné ngadungang kinon miwah RC, sané minab cocok ring fotosistem II (PSII) RC saking organisme fototrofik sané madaging oksigen. Temuan iraga ngicenin wawasan anyar indik kinetika pengikatan lan pertukaran kinon/kinolon ring kompleks inti RC-LH1 bakteri fototrofik ungu.
Mangda prasida ngawentenang tetilikan sane jangkep indik kalih kompleks sane kapanggihin ring Rps. palustris, iraga ngisolasi soang-soang RC-LH1 antuk metode biokimia. Kompleks defisiensi protein W (salanturnyane kasengguh ΔpufW) kamurniang saking galur sane nenten madue gen pufW (16), taler wantah asiki kompleks RC-LH1 sane prasida kakaryanin. Kompleks sané madaging protein W kakaryanin olih strain. Protein W saking galur puniki kauwah antuk tag His 10x ring C-terminus nyane, mawinan kompleks sane madaging protein W prasida kagabungan sareng protein W sane pinih kirang antuk ngamobilisasi logam. Kompleks punika efektif kapisahin (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Sekadi sane kacihnayang ring Gambar 1, makakalih kompleks punika madaging tiga sub-unit RC (RC-L, RC-M lan RC-H) sane kaiter olih antena LH1. Struktur 2,80-A saking kompleks sané nénten madué protein-W nyihnayang 16 heterodimer αβ, ngwentuk loop LH1 sané matutup sané jangkep ngiterin RC, salanturnyané kasengguh kompleks RC-LH116. Struktur 2,65Å saking kompleks sané madaging protein-W madué 14-heterodimer LH1 sané kagentosin olih protein-W, salanturnyané kasengguh RC-LH114-W.
(A lan B) Representasi permukaan senyawa sane wenten. (C lan D) Pigmen sane kaiket sane kacihnayang ring batang. (E lan F) Kompleks sane katitenin saking permukaan sitoplasma madue peptida lan subunit LH1 sane kawakilin ring kartun, lan kanomor manut arah jaum jam saking celah protein-W [konsisten sareng penomoran Rba. kompleks sferoid (13)]. Antuk LH1-α, warna subunit protein punika mawarna kuning; antuk LH1-β, warna subunit protein punika mawarna biru; antuk protein-W, protein punika mawarna barak; antuk RC-H, punika cyan; antuk RC-L, punika Oranye; antuk RC-M, warna barak. Kofaktor kacihnayang antuk batang, warna hijau nyihnayang molekul BChl miwah BPh a, ungu nyihnayang karotenoid, miwah warna kuning nyihnayang molekul UQ10. (G lan H) Pandangan sane kaagengang saking celah protein-W ring wewidangan sane pateh sareng kompleks RC-LH114-W (G) lan kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor kacihnayang marupa pengisian ruang, kinon kelat kacihnayang antuk warna biru. Celah protein-W kasorot antuk garis putus-putus biru ring (G), lan bolong-bolong alit ring dija quinone/quinolol madifusi ring cincin LH116 kasorot antuk garis putus-putus ireng ring (H).
Gambar 1 (A lan B) nyihnayang RC sane kaiter olih array heterodimer LH1αβ sane mabuka utawi matutup, soang-soang sane ngiket kalih BChl lan asiki karotenoid (Gambar 1, C lan D). Tetilikan sane sampun lintang sampun nyihnayang Rps inggih punika kompleks LH1. Ring jalur biosintesis xantin spirulina, spesies puniki madaging populasi campuran karotenoid (17). Nanging, spiropirroksantin inggih punika karotenoid sane dominan lan kepadatannyane prasida memuaskan. Punika mawinan, iraga milih model spiroxanthin ring makasami genah ngiket LH1. Polipeptida alfa lan beta inggih punika TMH tunggal antuk wewidangan luar membran sane cendet (Gambar 1, A, B, E, lan F). Yadiastun kepadatan 17 residu ring C-terminus nenten katitenin, polipeptida alfa kabelah saking Met1 ngantos Ala46 ring kalih kompleks punika. Polipeptida β kareduksi saking Gly4 dados Tyr52 ring RC-LH116, lan saking Ser5 dados Tyr52 ring RC-LH114-W. Nenten wenten kepadatan 3 utawi 4 residu N-terminal utawi 13 C-terminal sane katitenin (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks campuran RC-LH1 sane kasiagayang saking galur tipe liar nyihnayang genah sane ical inggih punika asil saking pembelahan heterolog peptida puniki (Gambar S1 lan S2). Formilasi N-terminal α-Met1 taler katitenin (f). Analisis nyihnayang α-peptida kawangun antuk residu fMet1 ngantos Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, lan β-peptida kawangun antuk residu Ser2 ngantos Ala53, sane manut becik sareng peta kepadatan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 lan β-His36 ngawinang BChls matemu muka; soang-soang heterodimer αβ mapupul sareng pisagannyane mangda prasida ngawentuk loop terbuka (RC-LH114-W) utawi loop tertutup (RC-LH116) ring sajeroning RC Array pigmen sane mapadu eksiton (Gambar 1, C lan D). Yening saihang sareng pita 877 nm RC-LH114-W, pergeseran barak penyerapan 880 nm RC-LH116 inggih punika 3 nm (Gambar 2A). Nanging, spektrum dikroisme lingkaran puniki meh-mehan pateh (Gambar 2B), nyihnayang yadiastun wenten pabinayan sane jelas pantaraning loop terbuka lan tertutup, lingkungan lokal BChls mesib pisan. Pergeseran merah penyerapan minab asil saking gerak termal sane ngidikang lan stabilitas sane nincap ring loop tertutup (18, 19), perubahan kopling pigmen sane kaawinang olih loop tertutup (20, 21), utawi kombinasi saking kalih efek puniki (11).
(A) Spektrum penyerapan ultraviolet/kacingak/inframerah nampek, puncaknyane kacihnayang antuk pigmen sane anut lan kanormalisasiang dados puncak BPh ring 775 nm. (B) Spektrum dikroisme lingkaran sane kanormalisasiang dados absorbansi BChl ring 805 nm. (C lan D) Spektrum ΔA sane kapilih saking spektrum penyerapan sane kapuputang antuk galah kompleks RC-LH114-W (C) lan kompleks RC-LH116 (D). Mangda prasida becikan, makasami spektrum kanormalisasiang dados ∆A saking −A ring 0,2 ps. (E) Tingkat oksidasi sitokrom c2 sesampun iradiasi ring kawentenan makudang-kudang konsentrasi UQ2 (cingak Gambar S8 antuk data mentah). (F) Ring sel sane mentik ring sor cahaya intensitas rendah, menengah utawi tinggi (10, 30 utawi 300μMm-2 s-1, soang-soang), subunit protein W lan RC-L ring kompleks sane kamurniang lan rasio membran sane kapisahin. Nentuang kadar protein antuk elektroforesis gel SDS-poliakrilamida miwah imunoassay (cingak Gambar S9 antuk data mentah). Nentuang rasio relatif majeng ring kompleks RC-LH114-W sane sampun kamurniang. Rasio stoikiometri RC-L sareng protein-W saking kompleks inggih punika 1:1.
BChl ring posisi 1 ring loop αβ14 sane cacat RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, lan E) nampek sareng donor primer RC (P) antuk 6,8Å bandingang BChl sane setara ring RC-LH116 (Gambar. 1, B, D); nanging, kinetika penyerapan transien saking kalih kompleks punika nyihnayang yening antuk RC-LH114-W lan RC-LH116, konstanta galah transfer energi eksitasi saking LH1 ka RC inggih punika 40 ±4 lan 44±3 ps (Gambar 2). , C miwah D, Gambar S4 miwah Tabel S2). Taler nenten wenten pabinayan sane signifikan ring transfer elektronik ring sajeroning RC (Gambar S5 lan teks pelengkap sane mapaiketan). Iraga curiga yening korespondensi sane raket saking galah transfer energi pantaraning LH1 lan RC-P puniki sangkaning jarak, sudut lan energi potensial sane pateh saking akehnyane BChl ring kalih loop LH1. Kacingak nglimbakang pola energi LH1 mangda prasida nyujur jarak minimal nenten gelisan saking transfer energi langsung saking situs suboptimal ka RC. Loop LH1 loop terbuka ring RC-LH114-W taler prasida ngamargiang gerak termal sane nenten signifikan ring kondisi suhu sane rendah anggen analisis struktural, lan wenten konformasi cincin αβ14 sane lantang ring suhu kamar saking jarak pigmentasi βBChls ring posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 madaging 32 BChl lan 16 karotenoid, lan susunnyane makasami pateh sareng sane kapolihang saking pidpidum Thermochromatium (Tch.) (12) miwah ganggang hijau (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Sesampune alignment, wantah deviasi alit ring posisi heterodimer αβ sane katitenin, utamanyane 1-5, 15, lan 16 (Gambar S6). Kawentenan protein-W madue ius sane signifikan ring struktur LH1. Tigang TMH-nyane kasambungang antuk loop sane cendet, antuk N-terminal ring sisi lumen kompleks lan C-terminal ring sisi sitoplasma (Gambar 1A lan 3, A ngantos D). Protein-W akehan hidrofobik (Gambar 3B), miwah TMH2 miwah TMH3 mapaiketan sareng LH1αβ-14 mangda prasida ngwentuk permukaan transmembran (Gambar 3, B miwah E ngantos G). Antarmuka utamanyane kawangun antuk residu Phe, Leu lan Val ring wewidangan transmembran. Residu puniki katumpuk antuk asam amino hidrofobik miwah pigmen αβ-14. Makudang-kudang residu polar taler prasida nagingin interaksi, rumasuk ikatan hidrogen pantaraning W-Thr68 miwah β-Trp42 ring baduur rongga kompleks (Gambar 3, F miwah G). Ring baduur sitoplasma, Gln34 nampek ring gugus keto karotenoid αβ-14. Tiosan ring punika, molekul n-dodesil β-d-maltoside (β-DDM) sampun kapuputang, miwah ikuh hidrofobiknyané nglimbak ring antarmuka pantaraning protein-W miwah αβ-14, miwah ikuh lipid minab magenah ring angga. Iraga taler nguratiang indik wewidangan resolusi C-terminal protein W lan RCH nampek pisan, nanging nenten ring lingkup ngawentuk interaksi spesifik (Gambar 1, A lan E). Nanging, minab wenten paiketan ring asam amino C-terminal sane durung kapuputang saking kakalih protein puniki, sane prasida ngicen tata cara anggen ngambil protein-W salami ngerakit kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, sane ngadep antarmuka sareng LH1αβ14 ring wangun kartun, madue rantai samping mawentuk batang (barak), kasinahang ring pahan diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan antuk tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W sane kawakilin olih permukaan sane mawarna hidrofobik. Wewidangan kutub miwah bermuatan kasinahang antuk warna cyan, wewidangan hidrofobik kasinahang antuk warna putih, miwah wewidangan hidrofobik sané kuat kasinahang antuk warna oranye. (C lan D) Protein-W sane kawakilin ring kartun, orientasinyane pateh sakadi ring (A) (C), lan mapiteh 180° (D). Manut genah ring dudonan, residu sane prasida kabinayang ngambil skema warna pelangi, ring dija terminal N mawarna biru lan terminal C mawarna barak. (E) Protein-W ring pandangan sane pateh sakadi ring (A), lan residu ring antarmuka protein-W:LH1 kawakilin olih batang antuk tanda sane melekat. (F) Protein-W kagilir 90 ̊ relatif ring (E) miwah LH1αβ14 ring representasi kartun, miwah relatif ring residu antarmuka ring representasi batang. Residu sane menjorok saking polipeptida beta kadagingin label. Kofaktor kacihnayang pinaka batang sane cocok sareng warna Gambar 1, β-DDM sane terurai kacihnayang antuk warna abu-abu, lan oksigen kacihnayang antuk warna barak. (G) Pandangan ring (F) kagilir 180 ̊, antuk residu sane menonjol saking polipeptida alfa sane madaging label.
Protein-W ngentosin heterodimer αβ (kaping 15 ring Gambar 1F), punika ngawinang prasida nambakin panutupan loop miwah miring tiga heterodimer αβ kapertama. Kacingak indik sudut kemiringan maksimum heterodimer αβ-1 kapertama relatif majeng ring normal film inggih punika 25 ̊ ngantos 29 ̊ (Gambar 1, A lan E), sane kawentuk olih kemiringan 2 ̊ ngantos 8 ̊ αβ-1 ring RC A kontras tajem-LH116 lan F (Gambar 1, B). Heterodimer kalih lan katiga soang-soang miring saking 12 ̊ kantos 22 ̊ lan 5 ̊ kantos 10 ̊. Sangkaning hambatan sterik RC, kemiringan αβ-1 nenten ngranjing pasangan αβ kaping kalih (sane manut sareng αβ kaping 16 ring Gambar 1F), mawinan ngawentuk celah sane jelas ring cincin LH1 (Gambar 1, A lan E) . Santukan kirangnyane kalih heterodimer αβ, kasarengin antuk ilangnyane petang BChl lan kalih karotenoid, nenten wenten karotenoid sane ngiket subunit αβ-1 sane memutar, ngasilang cincin LH114-W sane madaging 13 karotenoid Vegetarian lan 28 BChl. Perkiraan resolusi lokal saking kalih kompleks ring wewidangan αβ1 ngantos 7 kirang saking sisa loop LH1, sane minab nyihnayang plastisitas sane melekat ring subunit LH1 sane nampek sareng situs RC QB (Gambar 4) .
Gambar RC-LH114-W (A lan B) lan RC-LH116 (C lan D) kasinahang saking tampilan atas/tampilan sisi sane pateh (A lan B) (A lan C) lan permukaan rongga Gambar 1. (B lan D). Kunci sane mawarna punika kasinahang ring sisi tengen.
Wantah asiki kompleks inti karakteristik tiosan antuk rasio stoikiometri 1:14 inggih punika dimer RC-LH1-PufX (13). Nanging, protein W miwah PufX nénten madué homologi sané tinglas, miwah madué panglalah sané signifikan ring struktur LH1 soang-soang. PufX inggih punika TMH tunggal antuk domain sitoplasma N-terminal sané mapaiketan sareng sisi sitoplasma subunit RC-H (13) ring genah sané manut sareng Rps. sane marupa LH116αβ-16. PufX ngawetuang saluran antuk pertukaran kinon/kinolon pantaraning RC-LH1 lan kompleks sitokrom bcl lan wenten ring makasami Rba. kompleks inti sane wenten ring sferoid (13). Yadiastun antarmuka monomer-monomer wenten ring Rba. Dimer sferoid RC-LH1-PufX magenah ring genah ngiket protein W ring RC-LH114-W, lan celah sane kainduksi olih PufX lan protein-W magenah ring genah sane pateh (Gambar S7A). Celah ring RC-LH114-W taler mapaiketan sareng saluran kinon hipotetis (8) Pseudomonas rosea LH1, sane kawentuk olih peptida sane nenten mapaiketan sareng protein W utawi PufX (Gambar S7B). Tiosan ring punika, saluran kinon ring Blc. LH1 sane mawarna hijau zamrud sane kawentuk antuk ngecualiang siki subunit γ (7) magenah ring genah sane pateh (Gambar S7C). Yadiastun kamediasi olih protein sané matiosan, medalnyané saluran kinon/kinolol puniki ring genah sané pateh ring kompleks RC-LH1 kanten pinaka imba evolusi konvergen, nyihnayang indik celah sané kakaryanin olih protein W prasida dados saluran kinon.
Celah ring loop LH114-W ngawinang ngwentuk genah membran sané terus-terusan pantaraning genah internal kompleks RC-LH114-W miwah membran massal (Gambar 1G), bandingang nyambungang makakalih domain saking pori protein sekadi ring protein. Kompleks RC-LH116 puniki mirib sareng Tch sane matutup. Kompleks sane sekadi jaum (22) (Gambar 1H). Santukan difusi kinon saking membran gelisan saking difusi saking saluran protein sané cupit, loop LH114-W sané mabuka prasida ngawinang perputaran RC gelisan saking loop LH116 sané matutup, miwah difusi kinon ring RC minab sayan kawatesin. Mangda prasida nguji napike protein W ngawinang konversi kinon malarapan antuk RC, iraga ngamargiang assay oksidasi sitokrom ring konsentrasi tertentu ubikinon 2 (UQ2) (analog UQ10 alami antuk ikuh isopren sane cendet) (Gambar 2E). Yadiastun kawentenan kinon kelat ngawinang pikobet ring penentuan sane akurat saking konstanta Michaelis sane kacingak (RC-LH114-W lan RC-LH116 cocok antuk 0,2±0,1μM lan 0,5±0,2μM, soang-soang), tingkat maksimum RC-LH±0,2-6-1. ± 5% agengan saking RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Iraga ring pangawitnyane narka protein-W wenten ring sawatara 10% saking kompleks inti (16); iriki, tingkat penghunian sel pertumbuhan cahaya rendah, cahaya menengah, lan cahaya tinggi inggih punika 15±0,6%, 11±1% lan 0,9±0,5, soang-soang % (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri massa nyihnayang indik penambahan tag histidin nenten ngirangin kekayaan relatif protein-W yening saihang sareng strain tipe liar (P = 0,59), dadosnyane kadar puniki nenten artefak protein-W sane kauwah (Gambar S10). Sakéwanten, protein-W sané alit puniki ring kompleks RC-LH1 prasida ngawinang makudang-kudang RC prasida mabalik antuk kecepatan sané gelis, punika ngawinang prasida ngirangin panyiluran kinon/kinolon sané lambat ring kompleks RC-LH116. Iraga nguratiang indik tingkat penghunian cahaya sane tegeh nenten konsisten sareng data transkriptomik sane anyar, sane nyihnayang ekspresi gen pufW nincap ring sor cahaya sane kuat (Gambar S11) (23). Pabinayan pantaraning transkripsi pufW miwah protein-W sané karanjingang ring kompleks RC-LH1 ngawinang bingung miwah minab nyihnayang regulasi kompleks protein.
Ring RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) miwah 29 molekul β-DDM kaalokasiang miwah kamodelang ring tengahnyané 6 CDL, 24 POPC, 2 POPGDM miwah 12. RC-LH116 (Gambar 5, A miwah B). Ring kalih struktur puniki, CDL meh-mehan magenah ring sisi sitoplasma kompleks, nanging POPC, POPG lan β-DDM akehan magenah ring sisi luminal. Kalih molekul lipid lan deterjen kaisolasi ring wewidangan αβ-1 ngantos αβ-6 kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), lan lima kaisolasi ring wewidangan setara RC-LH116 (Gambar 5B ). Lebih akeh lipid sane kapanggihin ring sisi sane lianan saking kompleks, utamanyane CDL, mapupul ring pantaraning RC lan αβ-7 ngantos αβ-13 (Gambar 5, A lan B). Lipid miwah deterjen tiosan sané sampun kapuputang antuk struktural magenah ring jaba cincin LH1, miwah rantai asil sané sampun kapuputang becik nglimbak pantaraning subunit LH1, sané kasengguh pinaka β-DDM ring RC-LH114-W, miwah kategesang pinaka β-DDM ring RC A campuran βPOPC.HDLDM miwah βPOPC.HDL16. Posisi sane pateh saking lipid chelating lan deterjen ring struktur iraga nyihnayang indik punika pinaka genah pengikat sane relevan secara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul sane setara ring Tch taler madue konsistensi sane becik. Alus miwah Trv. Strain 970 RC-LH1s (Gambar S12, B ngantos E) (9, 12) lan residu ikatan hidrogen saking kelompok sirah lipid nyihnayang konservasi sane cukup becik ring peralihan urutan (Gambar S13), nyihnayang indik CDL sane kakonservasi sane ngiket RC (24), situs-situs puniki ring kompl-1.
(A lan B) Peptida RC-LH114-W (A) lan RC-LH116 (B) kacihnayang antuk kartun, lan pigmen kacihnayang antuk batang, nganggen skema warna ring Gambar 1. Lipid kacihnayang antuk warna barak, lan deterjen kacihnayang antuk warna abu-abu. UQ sane kaiket ring situs RC QA lan QB mawarna kuning, nanging UQ sane terisolasi mawarna biru. (C lan D) Pandangan sane pateh sareng (A) lan (B), antuk lipid sane kaicalang. (E ngantos G) Tampilan sane kagedeang saking Q1(E), Q2(F) lan Q3(G) saking RC-LH116, antuk rantai samping sane saling mapangaruh. Ikatan hidrogen kacihnayang pinaka garis putus-putus selem.
Ring RC-LH116, RC QA lan QB UQ, sane nyarengin transfer elektron ring proses pemisahan muatan, kaurai ring genah pengikatannyane. Nanging ring RC-LH114-W, QB quinone durung kapuputang lan pacang kabligbagang jangkep ring sor puniki. Tiosan ring kinon QA lan QB, kalih molekul UQ sane kakelat (sane magenah ring pantaraning cincin RC lan LH1) kaalokasiang ring struktur RC-LH114-W manut kelompok sirahnyane sane sampun kapuputang becik (sane magenah ring Q1 lan Q2, soang-soang). ruang). Gambar 5C). Kalih unit isoprene katetapang ring Q1, miwah peta kepadatan muputang 10 ikuh isoprene jangkep saking Q2. Ring struktur RC-LH116, tiga molekul UQ10 sane kakelat (Q1 ngantos Q3, Gambar 5D) kapuputang, lan makasami molekul madue kepadatan sane jelas ring makasami ikuh (Gambar 5, D ngantos G). Ring kalih struktur punika, genah kelompok sirah kinon Q1 lan Q2 madue konsistensi sane becik pisan (Gambar S12F), lan ipun wantah berinteraksi sareng RC. Q1 magenah ring pamedalan celah W RC-LH114-W (Gambar 1G lan 5, C, D lan E), lan Q2 magenah nampek ring genah pengikatan QB (Gambar 5, C, D) lan F). Residu L-Trp143 lan L-Trp269 sane kakonservasi nampek pisan sareng Q1 lan Q2 lan ngicenin interaksi π-stacking sane potensial (Gambar 5, E lan F, lan Gambar S12). L-Gln88, 3,0 Å saking oksigen distal Q1, ngicenin ikatan hidrogen sane kuat (Gambar 5E); residu puniki kakonservasi ring makasami RC sajabaning paiketan sane pinih doh (Gambar S13). L-Ser91 kagentosin antuk konservatif antuk Thr ring katahan RC tiosan (Gambar S13), inggih punika 3,8 Angstrom saking metil oksigen Q1, miwah prasida ngicénin ikatan hidrogen sané enduk (Gambar 5E). Q3 kacingak nenten madue interaksi spesifik, nanging magenah ring wewidangan hidrofobik pantaraning subunit RC-M lan subunit LH1-α 5 ngantos 6 (Gambar 5, D lan G). Q1, Q2 lan Q3 utawi kinon kelat sane nampek taler sampun kapuputang ring Tch. Alus, Trv. Galur 970 miwah Blc. Struktur iris (9, 10, 12) nujuang ring genah pengikatan kinon bantu sane kakonservasi ring kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Limang UQ sane kaurai ring RC-LH116 manut becik sareng 5,8±0,7 saking soang-soang kompleks sane katentuang olih kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC), nanging tiga UQ sane kaurai ring RC-LH114-W kirang saking Nilai sane kaukur saking molekul 6,2±0,3 are4 susunané.
Polipeptida L miwah M pseudo-simetris soang-soang madaging limang TMH miwah ngwentuk heterodimer sané ngabungin asiki dimer BChl, kalih monomer BChl, kalih monomer bakteriofag (BPh), miwah asiki besi non-Heme miwah asiki utawi kalih molekul UQ10. Malarapan antuk kawentenan ikatan hidrogen ring gugus keton terminal lan akumulasinyane sane kauningin ring Rps, karotenoid karanjingang ring subunit M, sane mawasta cis-3,4-dehidroorhodopin. Spesies (25). Domain membran sisi RC-H malabuh ring membran olih TMH tunggal. Struktur RC makasami mesib sareng tiga subunit RC spesies sane mapaiketan (sekadi Rba). sferoid (ID PDB: 3I4D). Makrosiklus BChl miwah BPh, tulang punggung karotenoid miwah besi non-heme matumpuk ring tengahing resolusi struktur puniki, sekadi kelompok sirah UQ10 ring situs QA miwah kinon QB ring RC-LH116 (Gambar S15).
Kawentenan kalih struktur RC antuk tingkat penghunian situs QB sane matiosan ngicenin galah anyar anggen nureksain pauwahan konformasi sane konsisten sane nyarengin pengikatan kinon QB. Ring kompleks RC-LH116, kinon QB magenah ring posisi “proksimal” sane jangkep kaiket (26), nanging pemisahan RC-LH114-W nenten madue kinon QB. Nenten wenten QB kinon ring RC-LH114-W, sane ngawinang angob santukan kompleks punika aktif, lebih saking kompleks RC-LH116 antuk kinon QB sane kapuputang secara struktural. Yadiastun kalih cincin LH1 ngelat sawatara nem kinon, lima sane kapuputang manut struktural ring cincin RC-LH116 sane matutup, nanging wantah tiga sane kawatesin manut struktural ring cincin RC-LH114-W sane mabuka. Peningkatan gangguan struktural puniki minab nyihnayang penggantian situs QB RC-LH114-W sane gelisan, kinetika kinon sane gelisan ring kompleks, lan nincapnyane kemungkinan nglintangin loop LH1. Iraga ngusulang indik kirangnyane UQ ring situs RC QB RC-LH114-W minab asil saking kompleks sane sayan kompleks lan sayan aktif, lan situs QB RC-LH114-W sampun langsung beku ring omset UQ Tahap spesifik (pintu masuk situs QB puniki sampun katutup a konformasi ref.
Tanpa QB, rotasi sane nyarengin L-Phe217 nuju posisi sane nenten manut sareng pengikatan UQ10, santukan pacang ngawinang tabrakan spasial sareng unit isoprene kapertama ikuh (Gambar 6A). Tiosan ring punika, pauwahan konformasi utama sane sampun janten sampun janten, utamanyane heliks de (heliks cendet ring loop pantaraning TMH D lan E) ring dija L-Phe217 kagingsirang ka kantong pengikat QB lan rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A ) Mangda prasida muputang ikatan hidrogen entrase saking M- situs (Gambar 6B). Heliks de pivot ring dasarnyané, Cα saking L-Ser209 magingsir 0,33Å, raris L-Val221Cα magingsir 3,52Å. Nenten wenten pauwahan sane prasida kacingak ring TMH D lan E, sane prasida katimpalin ring kalih struktur (Gambar 6A). Sakadi sane sampun kauningin, puniki wantah struktur kapertama ring RC alami sane nutup situs QB. Perbandingan sareng struktur sane jangkep (QB-bound) nyihnayang sadurung kinon punika kareduksi, kabuatang pauwahan konformasi mangda prasida ngranjing ring kinon. L-Phe217 maputa mangda prasida ngwentuk interaksi π-stacking sareng kelompok sirah quinone, miwah heliks magingsir ka jaba, punika ngawinang kerangka L-Gly222 miwah rantai samping L-Tyr223 ngwentuk jaringan ikatan hidrogen antuk struktur ikatan hidrogen sané stabil (Gambar 6, A miwah C).
(A) Kartun tumpang tindih saking hologram (rantai L, rantai oranye/M, magenta) lan struktur apo (abu-abu), ring dija residu kunci punika kasinahang marupa representasi sakadi batang. UQ10 puniki kacihnayang antuk bar sane mawarna kuning. Garis titik-titik nyihnayang ikatan hidrogen sané kawentuk ring makasami struktur. (B lan C) Representasi permukaan apolipoprotein lan struktur cincin makasami, nyorotang oksigen rantai samping L-Phe217 antuk warna biru lan L-Tyr223 antuk warna barak, soang-soang. Subunit L punika mawarna oranye; subunit M lan H nenten mawarna. (D lan E) Apolipoprotein (D) lan makasami (E) situs RC QB [warna antuk (A) soang-soang] lan Termofilus termofilus PSII (hijau, biru antuk kinon plastik; ID PDB: 3WU2) Sejajar (58).
Tan katenger, yadiastun makudang-kudang struktur RC sane defisiensi QB tanpa LH1 wenten, pauwahan konformasi sane katitenin ring tetilikan puniki durung kalaporang sadurungnyane. Punika rumasuk struktur depletion QB saking Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), sane sampun kasurat. tepidum (ID PDB: 1Mata) (28) miwah Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), makasami punika meh-mehan pateh sareng struktur QBnyane makasami. Inspeksi sane raket saking 3PRC nyihnayang molekul deterjen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ngiket ring pamedalan posisi QB, sane prasida ngandegang penataan malih dados konformasi sane matutup. Yadiastun LDAO nenten terurai ring genah sane pateh ring 1EYS utawi 1OGV, RC puniki kasiagayang nganggen deterjen sane pateh lan mawinan punika prasida ngasilang efek sane pateh. Struktur kristal sane wenten ring Rba. Sphaeroides RC sane bersama mengkristal sareng sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) taler kacingak madue situs QB sane matutup. Nanging, ring indiké puniki, genah N-terminal polipeptida RC-M (mapaiketan sareng genah ngiket QB saking ikatan H residu Tyr ring heliks Q) ngambil konformasi sané nénten alami, miwah pauwahan konformasi QB nénten kaselehin malih (30 ). Sane ngresepang inggih punika iraga durung nyingakin deformasi polipeptida M sakadi puniki ring struktur RC-LH114-W, sane meh-mehan pateh sareng wewidangan N-terminal RC-LH116 RC. Patut taler kauratiang yening sesampun eradikasi antena LH1 sane madasar antuk deterjen, RC apolipoprotein ring PDB kapuputang, sane ngicalang kolam kinon internal lan lipid ring celah pantaraning RC lan permukaan dalam ring LH1 sane ngiterin (31, 32). RC tetep mafungsi santukan nahanin makasami kofaktor, sajabaning kinon QB sane prasida kaurai, sane kirang stabil lan sering ical rikala proses persiapan (33). Tiosan ring punika, sampun kauningin indik ngicalang LH1 lan lipid siklik alami saking RC prasida ngicenin iusan ring fungsi, sakadi ngreredang masa hidup P+QB-state sane kapisahin antuk muatan (31, 34, 35). Punika mawinan, iraga maspekulasi indik kawentenan ring LH1 lokal sane ngiterin RC minab prasida ngajegang situs QB sane “tertutup”, antuk punika ngajegang lingkungan lokal sane nampek ring QB.
Yadiastun apolipoprotein (tanpa QB quinone) lan struktur sane jangkep wantah ngawakilin kalih jepretan saking perputaran situs QB, nenten serangkaian peristiwa, wenten indikasi indik pengikatan prasida kagate mangda nenten kaiket malih olih hidrokuin Mangda prasida ngambat inhibisi substrat. Interaksi kinolol miwah kinon nampek ring genah QB apolipoprotein minab mabinayan, sané ngawinang panulaknyané olih RC. Sampun sue kaunggahang indik pauwahan konformasi mabuat pisan ring ngiket miwah reduksi kinon. Kawagedan RC beku anggen ngirangin kinone sesampun adaptasi peteng punika rusak (36); Kristalografi sinar-X nyihnayang indik karusakan puniki sangkaning kinon QB sane kajebak ring konformasi “distal” sawatara 4,5 Å saking posisi proksimal aktif (26) , 37). Iraga ngusulang indik konformasi pengikatan distal puniki inggih punika jepretan saking kahanan perantara pantaraning apolipoprotein lan struktur cincin penuh, sane nginutin interaksi awal sareng kinon lan pembukaan situs QB.
RC tipe II sane kapanggihin ring kompleks PSII bakteri fototrofik tertentu lan cyanobakteri, ganggang lan entik-entikan madue konservasi struktural lan fungsional (38). Penjajaran struktural sane kasinahang ring Gambar 6 (D lan E) ngutamayang patehnyane RC PSII lan situs QB kompleks RC bakteri. Perbandingan puniki sampun sue dados model anggen malajahin sistem pengikatan lan reduksi kinon sane mapaiketan. Publikasi sadurungnyane nyihnayang indik pauwahan konformasi kasarengin antuk reduksi PSII kinon (39, 40). Punika mawinan, matetimbang konservasi evolusioner RC, mekanisme pengikatan sadurungnyané nénten kaselehin puniki taler prasida kamargiang ring genah QB PSII RC ring entik-entikan fototrofik sané madaging oksigen.
Rps ΔpufW (penghapusan pufW sane nenten madaging label) lan PufW-His (terminal C 10x protein-W sane katandain His sane kaekspresiang saking lokus pufW alami) strain. palustris CGA009 sampun katlatarang ring karya iraga sadurungnyane (16). Strain puniki miwah induk tipe liar isogenik kapolihang saking freezer antuk ngacoret akidik sel ring PYE (soang-soang 5 g liter -1) (kasimpen ring LB ring suhu -80 °C, madaging 50% ( w/v) protein gliserol, ekstrak ragi miwah suksinat (]% pla.w) agar/15. Piring punika kainkubasi semeng ring genah peteng ring suhu kamar ring kondisi anaerobik, lan salanturnyane katerangi antuk cahaya putih (~50 μmolm-2 s-1) sane kasediaang olih bohlam halogen OSRAM 116-W (RS Components, Inggris) salami 3 kantos 5 rahina kantos koloni tunggal medal. Koloni tunggal kaanggen inokulasi 10 ml media M22+ (41) sane kawewehin antuk 0,1% (w/v) asam kasamino (selanturnyane kasengguh M22). Budaya punika katumbuhin ring kahanan oksigen sane kirang ring genah peteng ring suhu 34°C antuk kagebug ring 180 rpm salami 48 jam, lan salanturnyane 70 ml budaya kainokulasi ring kahanan sane pateh salami 24 jam. Kultur semi-aerobik antuk volume 1 ml kaanggen inokulasi 30 ml media M22 ring botol kaca transparan sekrup universal 30 ml lan karadiasi antuk agitasi (~50 μmolm-2 s-1) salami 48 jam antuk gaya magnet steril Aduk rod. Raris 30 ml kultur punika kainokulasi antuk sawatara 1 liter kultur ring kondisi sane pateh, sane salanturnyane kaanggen inokulasi sawatara 9 liter kultur sane katerangi ring ~200 μmolm-2 s-1 salami 72 jam. Sel-sel punika kapanen antuk sentrifugasi ring 7132 RCF salami 30 menit, kasuspensi malih ring ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0), taler kasimpen ring suhu -20°C kantos kabuatang.
Sesampune ngelebur, tambahin makudang-kudang kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggris), lisozim (Merck, Inggris) lan kalih tablet inhibitor protease holoenzim Roche (Merck, Inggris) ring sel-sel sane kasuspensi malih. Ring sel tekanan Prancis 20.000 psi (Aminco, AS), sel-sel punika kagentosin 8 ngantos 12 kali. Sesampune ngicalang sel sane nenten pegat lan leburan sane nenten larut antuk sentrifugasi ring 18.500 RCF salami 15 menit ring suhu 4°C, membran kaendapang saking lisaat pigmen antuk sentrifugasi ring 113.000 RCF salami 2 jam ring suhu 43.000 °C. Buang fraksi sane larut lan kasuspensi malih membran sane mawarna ring 100 ngantos 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) lan homogenisasi kantos nenten wenten agregat sane kacingak. Membran sane kasuspensi kainkubasi ring tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, AS) sane madaging 2% (w/v) β-DDM salami 1 jam ring genah peteng ring suhu 4°C antuk kaaduk alus. Raris kasentrifugasi ring suhu 70°C mangda prasida nglarutang 150.000 RCF ring suhu 4°C salami 1 jam mangda prasida ngicalang residu sane nenten larut.
Membran pelarutan saking galur ΔpufW kaanggen ring kolom pertukaran ion Sepharose DEAE 50 ml antuk tiga volume kolom (CV) penyangga pengikat [20 mM tris-HCl (pH 8,0) sane madaging 0,03% (w/v) β-DDM]. Cuci kolom antuk kalih penyangga pengikat CV, lan salanturnyane cuci kolom antuk kalih penyangga pengikat sane madaging NaCl 50 mM. Kompleks RC-LH116 kaelusi antuk gradien linier 150 ngantos 300 mM NaCl (ring penyangga pengikat) ring 1,75 CV, lan kompleks pengikat sane masisa kaelusi antuk penyangga pengikat sane madaging 300 mM NaCl ring 0,5 CV. Mupulang spektrum absorpsi pantaraning 250 lan 1000 nm, simpen fraksi antuk rasio absorbansi (A880/A280) sane agengan saking 1 ring 880 ngantos 280 nm, encerkan kalih kalih ring penyangga pengikat, lan nganggen prosedur sane pateh malih ring kolom DEAE Ring pemurnian. Encerkan pecahan antuk rasio A880/A280 tegehan saking 1,7 lan rasio A880/A805 tegehan saking 3,0, laksanayang pertukaran ion babak kaping tiga, lan tahan pecahan antuk rasio A880/A280 tegehan saking 2,2 lan rasio A880/A805 tegehan saking0. Kompleks sane sampun kamurniang atenganyane kakonsentrasiang kantos ~2 ml ring filter sentrifugal cut-off berat molekul Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, Inggris), lan kamuat ring kolom eksklusi ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, AS) sane madaging penyangga NaC m 1,5 CV. Mupulang spektrum penyerapan saking fraksi eksklusi ukuran, lan konsentrasi spektrum penyerapan antuk rasio A880/A280 ring 2,4 lan rasio A880/A805 ring 5,8 ngantos 100 A880, lan langsung kaanggen antuk persiapan utawi penyimpanan grid cryo-TEM sane kabuatang untilC°0.
Membran pelarutan saking galur PufW-Nya kagenahang ring kolom Sefarosa HisPrep FF Ni-NTA 20 ml (tris-HCl 20 mM (pH 8,0) sane madaging NaCl 200 mM lan 0,03% (w/b)) ring penyangga IMAC Kesehatan ( GE). v) β-DDM]. Kolom kacuci antuk lima CV penyangga IMAC, lan selanturnyane antuk lima CV penyangga IMAC sane madaging histidin 10 mM. Kompleks inti kaelusi saking kolom antuk lima penyangga IMAC sane madaging histidin 100 mM. Fraksi sane madaging kompleks RC-LH114-W kakonsentrasiang kantos ~10 ml ring tangki kaaduk sane kalengkapin antuk filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, Inggris), kaencerang 20 kali antuk penyangga pengikat, lan salanturnyane kawewehin kantos 25 ml penyangga DEAE fo ring ajeng. Cuci kolom antuk petang penyangga pengikat CV, salanturnyane elusi kompleks ring kutus CV ring gradien linier 0 ngantos 100 mM NaCl (ring penyangga pengikat), lan petang CV sane masisa madaging penyangga pengikat 100 mM Kompleks residual A8de2 dielusi ring sori8de20. tegehan saking 2,4 lan rasio A880/A805 tegehan saking 4,6 fraksi kakonsentrasiang dados ~2 ml ring filter sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, lan kadagingin antuk 1,5 CV IMAC ring ajeng Penyangga kaimbangin Superdex 200 sane kaeksklusin ring penyangga 16/600. 1,5 CV. Mupulang spektrum absorpsi saking fraksi ukuran-eksklusif lan konsentrasi spektrum absorpsi antuk rasio A880/A280 langkungan saking 2,1 lan rasio A880/A805 langkungan saking 4,6 ngantos 100 A880, sane langsung kaanggen antuk persiapan grid TEM beku utawi kasimpen ring -80°C.
Freezer immersi Leica EM GP kaanggen nyiagayang kisi TEM suhu rendah. Kompleks punika kaencerang ring penyangga IMAC kantos A880 saking 50, lan salanturnyane 5μl kagenahang ring jaring tembaga sane malapis karbon QUANTIFOIL 1,2/1,3 sane anyar sane madaging cahaya (Agar Scientific, Inggris). Inkubasi kisi ring suhu 20°C lan kelembaban relatif 60% salami 30 s, raris blot punika tuh salami 3 s, lan salanturnyane padem ring etan cair ring suhu -176°C.
Data saking kompleks RC-LH114-W kacatet ring eBIC (Pusat Bioimaging Elektronik) (Sumber Cahaya Berlian Inggris) antuk mikroskop Titan Krios, sane makarya ring tegangan percepatan 300kV, antuk pembesaran nominal Choose gap 130.000 of-V lan Kuantum GIF Gatan 968 antuk detektor puncak K2 kaanggen ngarekam gambar ring mode ngitung anggen mupulang data. Ukuran piksel sane kakalibrasi inggih punika 1,048Å, lan tingkat dosis inggih punika 3,83 e-Å-2s-1. Mupulang pilem punika ring 11 detik lan kakepah dados 40 bagian. Anggen genah sane malapis karbon anggen fokus malih mikroskop, lan salanturnyane mupulang tiga film per bolong. Pamuputnyane, 3130 film sane kapupulang, antuk nilai defokus pantaraning -1 lan -3μm.
Data sane kaanggen ring kompleks RC-LH116 kapupulang nganggen mikroskop sane pateh ring Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data kapupulang antuk mode ngitung antuk pembesaran 130 k, lan ukuran piksel kakalibrasi kantos 1,065 Å antuk dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film puniki karekam ring galah 12 detik lan kakepah dados 48 bagian. Pamuputnyane, 3359 film sane kapupulang, antuk nilai defokus pantaraning -1 lan -3μm.
Makasami pemrosesan data kamargiang ring pipeline Relion 3.0 (42). Anggen Motioncorr 2 (43) anggen ngamecikang gerak balok antuk bobot dosis, lan salanturnyane nganggen CTFFIND 4.1 (44) anggen nentuang parameter CTF (fungsi transfer kontras). Fotomikrograf khas sesampun tahap pemrosesan awal puniki kasinahang ring Gambar 2. S16. Templat seleksi otomatis kapolihang antuk manual milih sawatara 250 piksel saking 1000 partikel ring bingkai 250 piksel lan nenten wenten referensi klasifikasi dua dimensi (2D), antuk punika nulak klasifikasi punika sane matemu sareng kontaminasi sampel utawi nenten madue karakteristik sane prasida kacingak. Raris, seleksi otomatis kamargiang ring makasami mikrofoto, lan RC-LH114-W inggih punika 849.359 partikel, lan kompleks RC-LH116 inggih punika 476.547 partikel. Makasami partikel sane kapilih sampun ngamargiang kalih babak klasifikasi 2D non-referensi, lan sesampun soang-soang lari, partikel sane matemu sareng area karbon, kontaminasi sampel, nenten wenten fitur sane jelas utawi partikel sane tumpang tindih sane kuat katulak, ngasilang 772.033 (90,9%) lan 359.657% klasifikasi antuk3578 parles (D) RC-LH114-W miwah RC-LH116 soang-soang. Model referensi 3D pangawit kapolihang nganggen metode turunan gradien stokastik. Ngawigunayang model pangawit pinaka acuan, partikel sane kapilih kaklasifikasiang dados petang soroh ring 3D. Ngawigunayang model ring kategori puniki pinaka acuan, ngamargiang pemurnian 3D ring partikel-partikel ring kategori sane pinih ageng, salanturnyane nganggen filter low-pass 15Å awal anggen nutupin area pelarut, nambahin 6 piksel sisi alus, lan pasca-proses piksel anggen ngamecikang fungsi transfer Gatan K2 puncak Mok. Antuk dataset RC-LH114-W, model pangawit puniki kauwah antuk ngicalang kepadatan sane kuat ring sisi topeng (kaputus saking kepadatan kompleks inti ring UCSF Chimera). Model sane kapolihang (resolusi RC-LH114-W lan RC-LH116 soang-soang inggih punika 3,91 lan 4,16 Å) kaanggen pinaka acuan antuk babak kalih klasifikasi 3D. Partikel sane kaanggen kakelompokang dados kelas 3D pangawit lan nenten madaging korelasi sane kuat sareng lingkungan. Tumpang tindih utawi kirangnyane fitur struktural sane sampun janten. Sesampune babak kaping kalih klasifikasi 3D, kategori sane madue resolusi pinih tegeh kapilih [Antuk RC-LH114-W, silih sinunggil kategori inggih punika 377.703 partikel (44,5%), antuk RC-LH116, wenten kalih kategori, akehnyane wantah 260.702 partikel, irika ipun sa7me. sesampun rotasi pangawit antuk pabinayan sane alit]. Partikel sane kapilih kaekstraksi malih ring kotak 400 piksel lan kamurniang antuk pemurnian 3D. Masker pelarut puniki kapolihang nganggen filter low-pass 15Å pangawit, ekspansi peta 3 piksel lan masker alus 3 piksel. Ngawigunayang pemurnian CTF per-partikel, koreksi gerak per-partikel lan babak kaping kalih pemurnian CTF per-partikel, pemurnian 3D, penyamakan pelarut lan pasca-pengolahan kalaksanayang sesampun soang-soang langkah mangda sayan ngamurniang tekstur sane kapolihang. Ngawigunayang nilai cut-off FSC (Koefisien Korelasi Cangkang Fourier) 0,143, resolusi model pamuput RC-LH114-W lan RC-LH116 soang-soang inggih punika 2,65 lan 2,80Å. Kurva FSC saking model pamuput kacihnayang ring Gambar 2. S17.
Makasami undagan protein punika kaunduh saking UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID Satu Protein: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) kaanggen ngwangun model homologi RC, sane madaging urutan protein RC-L, RC-M lan RC-H lan struktur kristal Rba. RC sane kaanggen pinaka cetakan (ID PDB: 5LSE) (46). Ngawigunayang alat “peta pas” ring Chimera UCSF mangda model sane kapolihang cocok sareng peta (47), nincapang struktur protein, lan kofaktor [4×BChl a (nama residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), siki utawi kalih soroh UQ10 (U10), siki non-heron lan siki non-heme) 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] nganggen Coot (48) anggen nambahin. Santukan QAK nenten wenten ring perpustakaan monomer, punika mawinan kaparameter nganggen alat eLBOW ring PHENIX (49).
Salanturnyane, subunit LH1 kawangun. Awalnyane, alat konstruksi otomatis ring PHENIX (49) kaanggen otomatis ngawangun pahan saking undagan LH1 nganggen peta lan undagan protein LH1-α lan LH1-β pinaka input. Pilih subunit LH1 sane pinih jangkep, ekstrak lan muat ring Coot, manual nambahin urutan sane ical ring jerone, lan manual ngrereh makasami struktur sadurung nambahin kalih BCls a (BCL) lan spirilloxanthin (CRT) [manut Rps sane relevan Kepadatan kompleks LH1 lan kandungan karotenoid sane kauningin. Spesies (17)]. Salin subunit LH1 sane jangkep, lan nganggen “Alat Peta Docking” Chimera UCSF anggen berlabuh ring area non-model sane nampek saking kepadatan LH1, lan salanturnyane ngrereh ring Coot; ulang proses punika kantos makasami subunit LH1 sampun kamodelin. Antuk struktur RC-LH114-W, antuk ngekstraksi kepadatan sane nenten kaalokasiang ring Coot, protein kapah saking komponen non-protein sane masisa ring peta Chimera USCF lan alat Autobuild kawigunayang anggen nyantenang model pangawit, lan subunit sane masisa (protein-W) Pemodelan. Ring PENIKS (49). Wewehin runtutan sane kirang ring model sane kapolihang ring Coot (48), lan salanturnyane manual ngamecikang makasami subunit. Kepadatan sane nenten kaalokasiang sane masisa cocok sareng kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB saking CDL = CDL, POPC = 6PL lan POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) lan molekul UQ10 (U10). Ngawigunayang optimasi PHENIX (49) lan optimasi manual ring Coot (48) anggen nyangkepin model pangawit sane jangkep kantos statistik model lan kualitas visual sane pas nenten prasida katincapang malih. Pamuputne, nganggen LocScale (50) antuk ngasah peta lokal, lan selanturne ngalaksanayang makudang-kudang siklus pemodelan kepadatan sane nenten kaalokasiang lan optimasi otomatis lan manual.
Peptida soang-soang, kofaktor miwah lipid miwah kinon tiosan sane berlabuh ring kepadatannyane soang-soang kasinahang ring Gambar 1 miwah 2. S18 ngantos S23. Gatra statistik saking model pamuput kacihnayang ring Tabel S1.
Sajabaning sampun katentuang tiosan, spektrum penyerapan UV/Vis/NIR kapupulang ring spektrofotometer Cary60 (Agilent, AS) ring interval 1 nm saking 250 nm ngantos 1000 nm miwah galah integrasi 0,1s.
Encerkan sampel ring kuvet kuarsa antuk jalur 2 mm nuju A880 saking 1, lan mupulang spektrum penyerapan pantaraning 400 lan 1000 nm. Spektrum dikroik malingseh kapupulang ring spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) ring interval 1 nm pantaraning 400 nm miwah 950 nm antuk kecepatan pindai 20 nm min-1.
Koefisien kepunahan molar katentuang antuk ngelebur kompleks inti dados A880 sane kirang langkung 50. Encerkan volume 10μl ring penyangga pengikat 990μl utawi metanol, lan digelis mupulang spektrum penyerapan mangda prasida ngirangin degradasi BChl. Kandungan BChl ring soang-soang sampel metanol kaitung antuk koefisien kepunahan ring 771 nm 54,8 mM-1 cm-1, lan koefisien kepunahan katentuang (51). Belah konsentrasi BChl sane kaukur antuk 32 (RC-LH114-W) utawi 36 (RC-LH116) anggen nentuang konsentrasi kompleks inti, sane salanturnyane kaanggen nentuang spektrum penyerapan saking sampel sane pateh sane kapupulang ring koefisien Kepunahan penyangga. mejéjér. Tigang pangukuran maulang-ulang kaambil antuk soang-soang sampel, lan absorbansi rata-rata maksimum BChl Qy kaanggen antuk ngitung. Koefisien kepunahan RC-LH114-W sane kaukur ring 878 nm inggih punika 3280±140 mM-1 cm-1, nanging koefisien kepunahan RC-LH116 sane kaukur ring 880 nm inggih punika 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 kaukur manut metode ring (52). Cutetnyane, HPLC fase mundur (RP-HPLC) kamargiang nganggen sistem HPLC Agilent 1200. Larutang sawatara 0,02 nmol RC-LH116 utawi RC-LH114-W ring 50μl metanol:kloroform 50:50 sane madaging 0,02% (w/v) besi klorida, lan suntikang pra-seimbangin Beckman Coulter Ultrasfer ODS m4-1. 40°C ring pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) ring kolom ×25 cm. Ngamargiang eluasi isokratik ring pelarut HPLC anggen ngawasin absorbansi ring 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) miwah 780 nm (BChl) salami 1 jam. Puncak ring kromatogram 275 nm ring 25,5 menit terintegrasi, sane nenten madaging senyawa sane prasida kadeteksi tiosan. Area terintegrasi kaanggen ngitung jumlah molar UQ10 sane kaekstraksi antuk nganutin kurva kalibrasi sane kaitung saking injeksi standar murni saking 0 ngantos 5,8 nmol (Gambar S14). Soang-soang sampel kaselehin ring tigang ulangan, lan kaiwangan sane kalaporang manut sareng SD saking rata-rata.
Larutan sane madaging kompleks RC-LH1 antuk penyerapan Qy maksimum 0,1 kakaryanin antuk 30 μM sitokrom jantung kuda sane kareduksi c2 (Merck, Inggris) lan 0 ngantos 50 μMUQ2 (Merck, Inggris). Tigang sampel 1 ml kakaryanin ring soang-soang konsentrasi UQ2 lan kainkubasi semeng ring genah peteng ring suhu 4°C mangda prasida mastikayang adaptasi sane jangkep ring genah peteng sadurung kaukur. Larutan punika kagenahang ring spektrofotometer modular OLIS RSM1000 sane kalengkapin antuk kisi api/500 garis 300 nm, celah masuk 1,24 mm, celah tengah 0,12 mm lan celah keluar 0,6 mm. Filter pass long 600 nm kagenahang ring pamedalan fototabung sampel lan tabung fotomultiplier referensi mangda nenten wenten cahaya eksitasi. Absorbansi kapantau ring 550 nm antuk galah integrasi 0,15 s. Cahaya eksitasi sane kamedalang saking LED M880F2 880 nm (Dioda Pemancar Cahaya) (Thorlabs Ltd., Inggris) marginin kabel serat optik antuk intensitas 90% marginin pengontrol DC2200 (Thorlabs Ltd., Inggris) lan kamedalang ring sumber cahaya ring sudut 0 ° 0. Berkas pangukuran punika kalawanin sareng cermin mangda mawali cahaya napi manten sane pangawitnyane nenten kaserep olih sampel. Monitor absorbansi 10 s sadurung penerangan 50 s. Raris absorbansi punika kapantau salanturnyane salami 60 s ring peteng anggen ngukur kantos ring dija kinolol spontan ngirangin sitokrom c23 + (cingak Gambar S8 antuk data mentah).
Data kaproses antuk nganutin tingkat awal linier ring 0,5 ngantos 10 s (manut ring konsentrasi UQ2) lan rata-rata tingkat saking tetiga sampel ring soang-soang konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 sane kaitung olih koefisien kepunahan soang-soang kawigunayang anggen nguwah kecepatan dados efisiensi katalitik, kagambarang ring Origin Pro 2019 (OriginLab, AS), taler kapasang ring model Michaelis-Menten anggen nentuang nilai Km miwah Kcat sane kapanggihang.
Antuk pangukuran penyerapan transien, sampel RC-LH1 kaencerang dados ~2 μM ring penyangga IMAC sane madaging natrium askorbat 50 mM (Merck, AS) lan Terbutin 0,4 mM (Merck, AS). Asam askorbat kaanggen pinaka donor elektron kurban, lan tert-butaclofen kaanggen pinaka inhibitor QB anggen mastikayang donor RC utama tetep kareduksi (inggih punika, nenten fotooksidasi) ring sajeroning proses pangukuran. Kirang langkung 3 ml sampel kawewehin ring sel rotasi khusus (kirang langkung 0,1 m diameter, 350 RPM) antuk panjang jalur optik 2 mm mangda sampel ring jalur laser madue galah sane cukup anggen adaptasi peteng pantaraning pulsa eksitasi. Ngawigunayang pulsa laser ~100-fs anggen ngukuhang sistem laser Ti: Safir (Fisika Spektra, AS) anggen ngawinang sampel ring 880 nm antuk kecepatan pengulangan 1 kHz (20 nJ antuk NIR utawi 100 nJ antuk Vis). Sadurung mupulang data, kagenahang sampel ring cahaya eksitasi sawatara 30 menit. Pamaparan pacang ngawinang inaktivasi QA (minab ngirangin QA apisan utawi kalih rahina). Nanging ngiring uratiang yening proses puniki prasida kabalikang santukan risampune suwe masa adaptasi peteng, RC pacang alon-alon mawali ring kegiatan QA. Spektrometer Helios (Sistem Ultracepat, AS) kawigunayang anggén ngukur spektrum transien antuk galah katunda -10 ngantos 7000 ps. Anggén piranti lunak Surface Xplorer (Sistem Ultrafast, AS) anggén nglepasin kelompok data, raris kagabungang miwah standarisasi. Ngawigunayang paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) anggen ngawigunayang himpunan data sane kagabungan anggen ngamolihang spektrum diferensial sane mapaiketan sareng peluruhan, utawi ngawigunayang fungsi sane nyarengang makudang-kudang eksponen antuk respons instrumen mangda manut sareng evolusi spektral panjang gelombang tunggal ring Asal (Asal USAb).
Sakadi sane sampun kabaosang ring ajeng (53), film fotosintesis sane madaging kompleks LH1 sane kirang antena RC lan antena LH2 perifer sampun kasiagayang. Membran punika kaencerang ring tris 20 mM (pH 8,0) lan salanturnyane kagenahang ring kuvet kuarsa antuk jalur optik 2 mm. Pulsa laser 30nJ kaanggen mangda prasida ngawinang sampel ring 540 nm antuk galah delay -10 ngantos 7000 ps. Ngolah pupulan data sakadi sane sampun katlatarang antuk Rps. conto pal.
Membran kapelet antuk sentrifugasi ring 150.000 RCF salami 2 jam ring suhu 4°C, raris absorbansinyane ring 880 nm kasuspensi malih ring tris-HCl 20 mM (pH 8,0) miwah NaCl 200 mM. Larutang membran antuk kaaduk alon-alon ring 2% (w/v) β-DDM salami 1 jam ring genah sane peteng ring suhu 4°C. Sampel kaencerang ring 100 mM trietilamonium karbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, Inggris) kantos konsentrasi protein 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pemrosesan salanturnyane kamargiang saking metode sane sampun katerbitang sadurungnyane (54), kakawitin antuk pengenceran protein 50 μg dados total 50 μl TEAB sane madaging 1% (w/v) natrium laurate (Merck, Inggris). Risampune sonikasi salami 60 s, punika kareduksi antuk 5 mM tris (2-karboksietil) fosfin (Merck, Inggris) ring suhu 37 °C salami 30 menit. Antuk S-alkilasi, inkubasi sampel antuk metil S-metiltiometansulfonat 10 mM (Merck, Inggris) lan kawewehin saking larutan stok isopropanol 200 mM salami 10 menit ring suhu kamar. Pencernaan proteolitik kamargiang antuk ngawewehin 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) lan kainkubasi ring suhu 37°C salami 3 jam. Surfaktan laurate kaekstraksi antuk ngawewehin 50 μl etil asetat lan 10 μl 10% (v/v) asam trifluoroasetat kelas LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Inggris) lan kaputer salami 60 s. Pemisahan fase punika kapromosiang antuk sentrifugasi ring 15.700 RCF salami 5 menit. Manut protokol pabrikan, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Inggris) kaanggen antuk becik ngaspirasi lan ngicalang uyah ring fase sor sane madaging peptida. Risampune kering antuk sentrifugasi vakum, sampel kalarutang ring 0,5% TFA miwah 3% asetonitril, taler 500 ng kaanalisis antuk kromatografi RP aliran nano sane kasarengin antuk spektrometri massa ngawigunayang parameter sistem sane sampun karincikan sadurungnyane.
Anggen MaxQuant v.1,5,3,30 (56) anggen identifikasi lan kuantifikasi protein anggen ngrereh Rps. basis data proteom palustris sane sampun kasurat ring ajeng. Data proteomik spektrometri massa sampun kasimpen ring Aliansi Pertukaran Proteome majalaran antuk repositori mitra PRIDE (http) ring sor pengidentifikasi dataset PXD020402.
Antuk analisis olih RPLC sane kasarengin antuk spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 kakaryanin saking Rps tipe liar. Ngawigunayang metode sane sampun kamedalang sadurungnyane (16), konsentrasi protein sane kaasilang ring sel palustris inggih punika 2 mg ml-1 ring Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM lan 0,03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Manut protokol pabrikan, nganggen kit pemurnian 2D (GE Healthcare, AS) anggen ngekstrak protein 10 μg antuk metode pengendapan, lan larutang endapan ring 20 μl 60% (v/v) asam formik (FA), 20% (v/v) Asetonitril/ 20% air. Limang mikroliter sane kaanalisis antuk RPLC (Dionex RSLC) sane kasarengin antuk spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Anggen kolom MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Inggris) antuk pemisahan ring suhu 60°C lan 100μlmin -1, antuk gradien 85% (v/v) pelarut A [0,1% (v/v) pelarut FA lan 0,02% (v/v) larutan BFA/v a [0,1%(v/v) FA lan 0,02%(v/v) ring 90%(v/v) asetonitril TFA] Nganggen sumber ionisasi elektrosemprot standar lan parameter default sane sampun langkungan saking 60 menit, spektrometer massa ngamolihang 100 ngantos 2750 m/z (rasio massa-ke-muatan). Antuk wantuan portal sumber daya bioinformatika ExPASy alat FindPept (https.
Sel-sel punika katumbuhin salami 72 jam ring sor 100 ml cahaya NF-rendah (10μMm-2 s-1), sedeng (30μMm-2 s-1) utawi tegeh (300μMm-2 s-1). Media M22 (media M22 sane amonium sulfat kaicalang lan natrium suksinat kagentosin antuk natrium asetat) ring botol sekrup 100 ml (23). Ring limang siklus 30-s, manik-manik kaca 0,1 mikron manik-manik antuk rasio volume 1:1 anggen ngalisis sel lan kadinginan ring es salami 5 menit. Bahan sane nenten larut, sel sane nenten pegat lan manik-manik kaca kaicalang antuk sentrifugasi ring 16.000 RCF salami 10 menit ring mikrosentrifugasi benchtop. Membran punika kapisahin ring rotor Ti 70,1 antuk 100.000 RCF ring tris-HCl 20 mM (pH 8,0) antuk gradien sukrosa 40/15% (w/w) salami 10 jam.
Sekadi sane sampun katlatarang ring karya iraga sadurungnyane, imunodeteksi tag His ring PufW (16). Cutetnyane, kompleks inti sane sampun kamurniang (11,8 nM) utawi membran sane madaging konsentrasi RC sane pateh (katentuang antuk oksidasi ngirangin spektrum pabinayan sane katedunang lan cocok sareng beban ring gel sane mawarna) ring 2x penyangga pemuatan SDS (Merck, Inggris) sane kaencerang ping kalih. Protein kapasahang ring replika gel NuPage bis-tris 12% (Thermo Fisher Ilmiah, Inggris). Gel kawarnai antuk Biru Cemerlang Coomassie (Bio-Rad, Inggris) anggen muat miwah ngagambarang subunit RC-L. Protein ring gel kaping kalih kagingsirang ring membran poliviniliden fluorida (PVDF) sane kaaktifang metanol (Thermo Fisher Scientific, Inggris) anggen imunoassay. Membran PVDF kablokir ring tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, susu bubuk skim Tween-20 lan 5% (w/v), lan salanturnyane ka-inkubasi antuk antibodi primer anti-His (ring penyangga mH0p 7,6), NaCl 150 mM lan 0,05% (v/v) Tween-20] ring 1:1000 A190-114A, Laboratorium Betil, AS) salami 4 jam. Sesampune kacuci 3 kali salami 5 menit ring penyangga antibodi, membran kagabungan sareng antibodi sekunder anti-bikul lobak peroksidase (Sigma-Aldrich, Inggris) (kaencerang 1:10.000 ring penyangga antibodi) Inkubasi mangda prasida kadeteksi (5 menit sesampun 3 kali kacuci ring penyangga antibodi kemistrat EESTA0). (Cyanagen, Italia) miwah Pencitra Amersham 600 (Perawatan Kesehatan GE, Inggris).
Antuk ngambar distribusi intensitas soang-soang gel berwarna utawi jalur imunoassay, ngadungang area ring sor puncak lan ngitung rasio intensitas RC-L (gel berwarna) lan Protein-W (imunoassay), ring ImageJ (57) Ngolah gambar. Rasio puniki kauwah dados rasio molar antuk ngasumsiang indik rasio RC-L sareng protein-W ring sampel RC-LH114-W murni inggih punika 1:1 lan normalisasi makasami pupulan data sane manut.
Antuk materi paweweh ring artikel puniki, durusang cingakin ring http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/7/3/eabe2631/DC1.
Puniki artikel akses terbuka sané kasobyahang ring sor syarat Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel punika ngicenin kawigunan, distribusi, lan reproduksi sane nenten kawatesin ring media napi kemanten antuk syarat karya aslinyane sampun kakutipang manut.
Catetan: Google wantah nunas mangda Sameton ngicénin alamat email mangda jadma sané kaanjurang ring laman punika uning yéning Sameton meled nyingakin email punika lan email punika nénten spam. Google nénten pacang ngambil alamat email napi-napi.
Pitakén puniki kaanggén nguji napiké Sameton dados pengunjung lan nyegah pengiriman spam otomatis.
David j.k.
Struktur resolusi tinggi kompleks jebakan cahaya 1 ring pusat reaksi ngicenin wawasan anyar indik dinamika kinon.
David j.k.
Struktur resolusi tinggi kompleks jebakan cahaya 1 ring pusat reaksi ngicenin wawasan anyar indik dinamika kinon.
©2021 Asosiasi Amerika antuk Panglimbak Ilmu Pengetahuan. samian hak sampun kacawis. AAAS inggih punika mitra saking HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Lintas miwah PENGHITUNG. Kemajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.