Sane mangkin *Alamat sane mangkin: Köln 50931, Jerman, Penelitian Klaster Keunggulan Köln indik Respons Stres Seluler ring Penyakit sane Mapaiketan sareng Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi saking panyungkan mitokondria kasengguh nénten prasida kabalikang santukan plastisitas metabolisme neuron kawatesin, sakéwanten panglalah saking disfungsi mitokondria ring otonomi sel metabolisme neuron ring angga durung tatas kauningin. Iriki, iraga nyobyahang proteom spesifik sel neuron Purkinje antuk defisiensi OXPHOS progresif sane kaawinang olih dinamika fusi mitokondria sane terganggu. Iraga manggihin indik disfungsi mitokondria ngawinang pauwahan sané ageng ring widang proteomik, sané pamuputnyané ngawinang aktivasi sekuensial program metabolisme sané becik sadurung sel padem. Tan kajangka, iraga nentuang induksi sane jelas saking piruvat karboksilase (PCx) lan enzim anti-aging sane lianan sane nyangkepin perantara siklus TCA. Inhibisi PCx ngawinang stres oksidatif lan neurodegenerasi sayan ngakehang, nyihnayang aterosklerosis madue efek perlindungan ring neuron sane kirang OXPHOS. Restorasi fusi mitokondria ring neuron sané sampun degenerasi terminal prasida nungkalik karakteristik metabolisme puniki, raris prasida nambakin sel sané padem. Temuan iraga ngidentifikasi jalur sane sadurungnyane nenten kauningin sane ngicenin ketahanan majeng ring disfungsi mitokondria lan nyihnayang neurodegenerasi prasida kabalikang yadiastun ring tahap pamuput penyakit.
Peran sentral mitokondria ring miara metabolisme energi neuronal katekanin olih gejala neurologis sané ekstensif sané mapaiketan sareng panyungkan mitokondria manusa. Akéhan saking panyungkan puniki sangkaning mutasi gen sané ngatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) utawi karusakan gen sané mapaiketan sareng dinamika mitokondria, sané nénten langsung ngawinang stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Pakaryan ring model buron sampun nyihnayang indik pinaka penampén saking disfungsi mitokondria ring jaringan sané nampek, jalur metabolisme konservatif (5-7) prasida kaaktifang, sané ngicénin informasi sané mabuat pisan mangda prasida ngresepang patogenesis saking pinungkan sané kompleks puniki. Matungkalik pisan, pangresepan iraga indik pauwahan metabolisme saking soroh sel tertentu sane kaawinang olih kegagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak punika fundamental (8), sane ngutamayang kabuatang antuk ngidentifikasi target terapeutik sane prasida kaanggen nyegah utawi nyegah penyakit. Nyegah degenerasi saraf sane wenten (9). Kirangnyane informasi inggih punika fakta indik sel saraf sane sampun kaloktah madue fleksibilitas metabolisme sane pinih kawatesin yening saihang sareng jenis sel jaringan sane wenten ring sekitarnyane (10). Nyelehin indik sel-sel puniki madue peran sentral ring koordinasi pasokan metabolit ring neuron anggen ngalimbakang transmisi sinaptik lan menanggapi kondisi tatu lan penyakit, kemampuan nganutin metabolisme sel ring kondisi jaringan otak sane nantangin puniki meh-mehan kawatesin ring sel glial (11-14). Tiosan ring punika, heterogenitas seluler sané melekat ring jaringan otak katahan ngawinang pikobet ring panyelehan indik pauwahan metabolisme sané mamargi ring subgrup neuronal tertentu. Punika mawinan, akidik sané kauningin indik konsekuensi seluler miwah metabolisme sané pastika saking disfungsi mitokondria ring neuron.
Mangda prasida ngresepang konsekuensi metabolisme saking disfungsi mitokondria, iraga ngisolasi neuron Purkinje (PN) ring tahap neurodegenerasi sane mabinayan sane kaawinang olih karusakan fusi membran luar mitokondria (Mfn2). Yadiastun mutasi Mfn2 ring manusa mapaiketan sareng wentuk neuropati sensorik motorik herediter sané kaloktah pinaka Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), karusakan kondisional Mfn2 ring bikul inggih punika induksi disfungsi oksidasi Fosforilasi (OXthoPHOS) sané sampun kauningin. Makudang-kudang subtipe neuron (16-19) lan fenotipe neurodegeneratif sane kapolihang kasarengin antuk gejala neurologis sane progresif, sakadi gangguan gerak (18, 19) utawi ataksia serebelum (16). Antuk nganggen kombinasi proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, lan metode virologis, iraga nyihnayang indik neurodegenerasi progresif kuat ngawinang piruvat karboksilase (PCx) lan faktor-faktor sane lianan sane nyarengin ring arteriosklerosis PN in vivo Ekspresi enzim. Anggen mastikayang relevansi saking pikolih puniki, iraga khusus ngatur ekspresi PCx ring PN sane defisiensi Mfn2, lan manggihin indik operasi puniki ngawinang stres oksidatif sayan ngakehang lan neurodegenerasi sane gelis, punika nyihnayang azoospermia ngicenin kematian sel adaptabilitas metabolisme. Ekspresi parah MFN2 prasida jangkep ngluputang degenerasi terminal PN antuk defisiensi OXPHOS sane parah, konsumsi DNA mitokondria sane ageng, lan kacingak jaringan mitokondria sane pegat, sane salanturnyane negesang indik wangun neurodegenerasi puniki malah prasida seger ring tahap degenerasi sel lanjut saking penyakit.
Mangda prasida ngawigunayang mitokondria ring PN knockout Mfn2, iraga ngawigunayang galur bikul sane ngawinang mitokondria sane gumantung ring Cre mangda prasida nargetang protein fluoresen kuning (YFP) (mtYFP) (20) ekspresi Cre lan nureksain morfologi mitokondria ring vivo. Iraga manggihin indik karusakan gen Mfn2 ring PN pacang ngawinang pembelahan bertahap jaringan mitokondria (Gambar S1A), lan pauwahan sane pinih riin kapanggihin ring yusa 3 minggu. Semaliha, degenerasi substansial lapisan sel PN, sekadi sane kabuktiang antuk ilangnyane imunostaining Calbindin, nenten kakawitin kantos yusa 12 minggu (Gambar 1, A lan B). Galah sané nénten manut pantaraning pauwahan morfologi mitokondria miwah pangawit padem neuron sané kanten ngawinang iraga nyelehin pauwahan metabolisme sané kamedalang olih disfungsi mitokondria sadurung sel padem. Iraga nglimbakang strategi madasar antuk penyortiran sel sane kaaktifang fluoresensi (FACS) anggen ngisolasi PN sane ngekspresiang YFP (YFP +) (Gambar 1C), lan ring bikul kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), salanturnyane kasengguh CT1BRL (Gambar). Optimasi strategi gerbang madasar antuk intensitas relatif sinyal YFP ngawinang iraga prasida nyuciang awak YFP + (YFPhigh) saking PN saking non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) utawi fragmen akson / dendritik fluoresen sane kapercaya (YFPlow; Gambar S1D, kiwa). Mangda prasida ngeverifikasi identitas populasi sane kaklasifikasiang, iraga ngamargiang proteomik LFQ lan salanturnyane analisis komponen utama, lan manggihin wenten pabinayan sane jelas pantaraning sel YFPhigh lan YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh nyihnayang pengayaan bersih saking penanda PNs sane kauningin (inggih punika Calb1, Pcp2, Grid2 lan Itpr3) (21, 22), nanging nenten wenten pengayaan protein sane lumrah kaekspresiang ring neuron utawi jenis sel sane lianan (Gambar 1D) ). Perbandingan pantaraning sampel ring sel YFPhigh sane kaklasifikasiang sane kapupulang ring percobaan independen nyihnayang koefisien korelasi> 0,9, nyihnayang reproduksi sane becik pantaraning ulangan biologis (Gambar S1E). Cutetnyane, data puniki validasi rencana iraga antuk isolasi akut lan spesifik PN sane layak. Santukan sistem penggerak L7-cre sane kaanggen nginduksi rekombinasi mosaik ring minggu kapertama sesampun melahirkan (23), iraga ngawitin ngamademang bikul saking CTRL lan kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Mupulang neuron. Sesampune rekombinasi puput, punika kawastanin Mfn2cKO ring yusa 4 minggu. Pinaka titik pamuput, iraga milih yusa 8 minggu ritatkala lapisan PN utuh yadiastun fragmentasi mitokondria sane jelas (Gambar 1B lan Gambar S1A). Pamuputnyane, iraga ngukur akehnyane 3013 protein, sane sawatara 22% kadasarin antuk anotasi MitoCarta 2.0 kadasarin antuk proteom mitokondria pinaka mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial sané kamargiang ring minggu kaping 8 nyihnayang wantah 10,5% saking makasami protein sané madué pauwahan sané signifikan (Gambar 1F miwah Gambar S1F), saking punika 195 protein kaatur ring sor miwah 120 protein kaatur ring baduur (Gambar 1F). Patut kauratiang yening “analisis jalur inovatif” saking kumpulan data puniki nyihnayang gen sane kaekspresiang diferensial utamanyane ngranjing ring kumpulan jalur metabolisme spesifik sane kawatesin (Gambar 1G). Sané becik, yadiastun downregulation jalur sané mapaiketan sareng OXPHOS miwah sinyal kalsium nyantenang induksi disfungsi mitokondria ring PN defisiensi fusi, kategori tiosan sané utamanyané nyarengin metabolisme asam amino sané signifikan kaatur, sané manut ring metabolisme kondrion P N. disfungsi.
(A) Foto konfokal perwakilan saking bagian otak bikul CTRL lan Mfn2cKO sane nyihnayang ilangnyane PN sane progresif (calbindin, abu-abu); inti sane kawarnai antuk DAPI. (B) Kuantifikasi saking (A) (analisis varians satu arah, ***P<0,001; n = 4 ngantos 6 lingkaran saking tiga bikul). (C) Alur pakaryan sane kaanggen ring eksperimen. (D) Distribusi peta panas penanda khusus Purkinje (duur) lan jenis sel sane lianan (tengah). (E) Diagram Venn sane nyihnayang akeh protein mitokondria sane kaidentifikasi ring PN sane kaklasifikasiang. (F) Plot gunung berapi protein sane kaekspresiang diferensial ring neuron Mfn2cKO ring 8 minggu (nilai cut-off signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas nyihnayang lima jalur up-regulation (merah) lan down-regulation (biru) sane pinih utama ring PN Mfn2cKO sane kaklasifikasiang dados 8 minggu. Tingkat ekspresi rata-rata saking soang-soang protein sane kadeteksi kasinahang. Peta panas skala abu-abu: nilai P sane kasesuaiang. ns, nenten penting.
Data proteomik nyihnayang ekspresi protein kompleks I, III, lan IV saka kidik sayan rered. Kompleks I, III, lan IV makasami madaging subunit sane kakodekan mtDNA esensial, nanging kompleks II, sane wantah kakodekan nuklir, dasarnyane nenten keni ius (Gambar 2A lan Gambar S2A). . Konsisten sareng pikolih proteomik, imunohistokimia bagian jaringan serebelum nyihnayang indik MTCO1 (mitokondria sitokrom C oksidase subunit 1) tingkat subunit kompleks IV ring PN saka kidik sayan rered (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 sané kakodekan mtDNA sayan ngidikang (Gambar S2A), raris undagan kahanan stabil subunit sintase ATP sané kakodekan inti tetep nénten mauwah, sané konsisten sareng kompleks subassembly F1 sintase ATP stabil sané kauningin rikala ekspresi mtDNA stabil. Pambentukannyane konsisten. Mengganggu (7). Evaluasi tingkat mtDNA ring PN Mfn2cKO sane kasorohang antuk reaksi berantai polimerase real-time (qPCR) nyantenang indik panurunan bertahap ring jumlah salinan mtDNA. Yening saihang sareng kelompok kontrol, ring yusa 8 minggu, wantah sawatara 20% saking kadar mtDNA Was kapertahanin (Gambar 2C). Konsisten sareng pikolih puniki, pewarnaan mikroskop konfokal Mfn2cKO PNs kawigunayang anggen mendeteksi DNA, nyihnayang konsumsi nukleotida mitokondria sane gumantung ring galah (Gambar 2D). Iraga manggihang wantah makudang kandidat sane kasarengin ring degradasi protein mitokondria miwah respons stres sane kaatur, rumasuk Lonp1, Afg3l2 miwah Clpx, miwah faktor perakitan kompleks OXPHOS. Nenten wenten pauwahan sane signifikan ring tingkat protein sane kasarengin ring apoptosis sane kadeteksi (Gambar S2B). Asapunika taler, iraga manggihin saluran mitokondria lan retikulum endoplasma sane nyarengin ring transportasi kalsium wantah madue perubahan sane alit (Gambar S2C). Tiosan ring punika, evaluasi protein sané mapaiketan sareng autofagi nénten manggihin pauwahan sané signifikan, sané manut sareng induksi sané kanten saking autofagosom sané kaselehin ring vivo olih imunohistokimia miwah mikroskopi elektron (Gambar S3). Nanging, disfungsi OXPHOS sane progresif ring PN kasarengin antuk pauwahan mitokondria ultrastruktur sane sampun janten. Gugus mitokondria prasida kacingak ring awak sel lan pohon dendritik PN Mfn2cKO sane mayusa 5 lan 8 minggu, lan struktur membran dalam sampun ngamargiang perubahan sane dalem (Gambar S4, A lan B). Konsisten sareng pauwahan ultrastruktur puniki lan panurunan mtDNA sane signifikan, analisis irisan otak otak akut antuk tetrametilrodamin metil ester (TMRM) nyihnayang potensi membran mitokondria ring PN Mfn2cKO signifikan panurunan (Gambar S4C).
(A) Analisis pamargin galah saking undagan ekspresi kompleks OXPHOS. Wantah nguratiang protein antuk P<0,05 ring 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis titik-titik: Nénten wénten penyesuaian yéning saihang sareng CTRL. (B) Kiwa: Conto bagian otak kecil sane madaging label antibodi anti-MTCO1 (skala bar, 20 μm). Wewidangan sane kagenahin olih awak sel Purkinje punika katutupin antuk warna kuning. Tengen: Kuantifikasi kadar MTCO1 (analisis varians satu arah; n = 7 ngantos 20 sel sane kaanalisis saking tiga bikul). (C) Analisis qPCR jumlah salinan mtDNA ring PN sane kasorot (analisis varians satu arah; n = 3 ngantos 7 bikul). (D) Kiwa: Conto irisan otak kecil sane madaging label antuk antibodi anti-DNA (skala bar, 20 μm). Wewidangan sane kagenahin olih awak sel Purkinje punika katutupin antuk warna kuning. Tengen: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians satu arah; n = 5 ngantos 9 sel saking tiga bikul). (E) Conto bagian serebelum akut sane nyihnayang sel mitoYFP + Purkinje (panah) ring rekaman penjepit tambalan sel seluruh. (F) Kuantifikasi kurva IV sane kalaksanayang. (G) Rekaman perwakilan suntikan arus depolarisasi ring sel Purkinje CTRL lan Mfn2cKO. Jejak atas: Pulsa pertama sane memicu AP. Jejak ring sor: Frekuensi AP maksimal. (H) Kuantifikasi input spontan pascasinaptik (sPSP). Jejak rekaman representatif lan rasio zoomnyane kasinahang ring (I). Analisis varians satu arah sane kaanalisis n = 5 ngantos 20 sel saking tiga bikul. Data sane kacihnayang antuk rata-rata±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Jejak representatif AP spontan sane kacatet nganggen mode penjepit tambalan berlubang. Jejak ring baduur: Frekuensi AP maksimal. Jejak ring sor: zoom saking AP tunggal. (K) Ngukur frekuensi AP rata-rata lan maksimum manut (J). Tes Mann-Witney; n = 5 sel sane kaanalisis saking petang bikul. Data sane kacihnayang antuk rata-rata±SEM; nenten penting.
Kerusakan OXPHOS sane sampun janten kadeteksi ring Mfn2cKO PN sane mayusa 8 minggu, nyihnayang fungsi fisiologis neuron sane sanget abnormal. Punika mawinan, iraga nganalisis karakteristik listrik pasif neuron sane defisiensi OXPHOS ring 4 ngantos 5 minggu lan 7 ngantos 8 minggu antuk ngamargiang rekaman penjepit tambalan sel seluruh ring irisan serebelum akut (Gambar 2E). Tan katenger, rata-rata potensi membran istirahat lan resistensi input neuron Mfn2cKO mesib sareng kontrol, yadiastun wenten pabinayan halus pantaraning sel (Tabel 1). Asapunika taler ring yusa 4 ngantos 5 minggu, nenten wenten pauwahan sane signifikan ring hubungan arus-tegangan (kurva IV) sane kapanggihin (Gambar 2F). Nanging, nenten wenten neuron Mfn2cKO sane mayusa 7 ngantos 8 minggu sane prasida nglanturang rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), nyihnayang wenten sensitivitas sane jelas majeng ring potensi hiperpolarisasi ring tahap pamuput puniki. Semaliha, ring neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi sané ngawinang debit potensial aksi berulang (AP) prasida katerima becik, nyihnayang pola debit ipun makasami nénten signifikan mabinayan sareng neuron kontrol sané mayusa 8 minggu (Tabel 1 miwah Gambar 2G). Asapunika taler frekuensi lan amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSC) pateh sareng kelompok kontrol, lan frekuensi peristiwa nincap saking 4 minggu ngantos 5 minggu ngantos 7 minggu ngantos 8 minggu antuk nincap sane pateh (Gambar 2, H lan I). Periode pematangan sinaptik ring PN (25). Pikolih sane pateh kapolihang sesampun patch PNs berlubang. Konfigurasi puniki ngandegang kompensasi sane minab saking cacat ATP seluler, sekadi sane minab kemargiang ring rekaman klem patch seluruh sel. Secara khusus, potensi membran istirahat lan frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO nenten keni ius (Gambar 2, J lan K). Cutetnyane, pikolih puniki nyihnayang PN sane madue disfungsi OXPHOS sane jelas prasida ngarepin pola debit frekuensi tinggi antuk becik, nyihnayang wenten mekanisme kompensasi sane ngawinang ipun prasida ngajegang respons elektrofisiologis sane nampek normal.
Data kacihnayang antuk rata-rata ± SEM (analisis varians satu arah, tes perbandingan berganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomor satuan punika kacihnayang antuk kurung.
Iraga ngarencanayang nyelehin napike kategori napi kemanten ring dataset proteomik (Gambar 1G) ngranjing jalur sane prasida nanganin defisiensi OXPHOS sane parah, antuk punika nlatarang napi mawinan PN sane keni ius prasida miara elektrofisiologi sane nampek normal (Gambar 2, E ngantos K). . Analisis proteomik nyihnayang indik enzim sané nyarengin ring katabolisme asam amino berantai bercabang (BCAA) sané signifikan kaatur (Gambar 3A miwah Gambar S5A), miwah produk pamuput asetil-CoA (CoA) utawi suksinil CoA prasida nyangkepin trikarboksilat ring arteriosklerosisTCA). Iraga manggihin indik kandungan transaminase BCAA 1 (BCAT1) lan BCAT2 makakalih nincap. Ipun ngamargiang katalisis pamargi kapertama katabolisme BCAA antuk ngasilang glutamat saking α-ketoglutarat (26). Makasami subunit sané ngwangun kompleks keto asam dehidrogenase (BCKD) rantai bercabang kaatur (kompleks punika ngamargiang katalisis dekarboksilasi selanturnyané miwah nénten prasida kabalikang saking kerangka karbon BCAA sané kaasilang) (Gambar 3A miwah Gambar S5A). Nanging, nenten wenten pauwahan sane jelas ring BCAA punika kapanggihin ring PN sane kasorot, sane minab sangkaning nincapnyane pengambilan seluler asam amino esensial puniki utawi nganggen sumber sane lianan (glukosa utawi asam laktat) anggen nyangkepin siklus TCA (Gambar S5B). PN sane kirang OXPHOS taler nyihnayang nincapnyane dekomposisi glutamin lan aktivitas transaminasi ring yusa 8 minggu, sane prasida kacihnayang olih up-regulasi enzim mitokondria glutaminase (GLS) lan glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A lan C). Patut kauratiang indik up-regulasi GLS kawatesin ring isoform glutaminase C sane kasambung (GLS-GAC) (pauwahan Mfn2cKO/CTRL kirang langkung 4,5 kali lipat, P = 0,05), lan up-regulasi spesifiknyane ring jaringan bionergion Prasida ngadukung mitokondria. (27).
(A) Peta panas nyihnayang perubahan lipatan ring kadar protein antuk rute sane sampun katentuang ring 8 minggu. (B) Conto irisan otak sane madaging label antibodi anti-PCx (skala bar, 20 μm). Panah sane mawarna kuning nujuang ring awak sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein pamargin galah sane kaidentifikasi pinaka kandidat sane mabuat ring aterosklerosis (uji t berganda, *FDR <5%; n = 3-5 bikul). (D) Ring ajeng: Diagram skematis sane nyihnayang cara sane mabinayan ngeranjing karbon sane madaging label sane wenten ring [1-13C]piruvat tracer (inggih punika, marginin PDH utawi rute trans-arteri). Ring sor: Bagan biola nyihnayang persentase karbon sane madaging label tunggal (M1) sane kauwah dados asam aspartat, asam sitrat lan asam malat sesampun malabel irisan serebelum akut antuk [1-13C]piruvat (uji t berpasangan; ** P <0,01). (E) Panyelehan sejarah galah sane jangkep indik pamargi sane kacihnayang. Wantah nguratiang protein antuk P<0,05 ring 8 minggu. Garis putus-putus: nenten wenten nilai penyesuaian (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data sane kacihnayang pinaka rata-rata±SEM.
Ring panyelehan iraga, katabolisme BCAA sampun dados silih tunggil jalur up-regulation utama. Kasujatian puniki banget nyihnayang volume ventilasi sane ngranjing ring siklus TCA minab kauwah ring PN sane kirang OXPHOS. Puniki minab pinaka wentuk utama saking pengambilan ulang metabolisme neuronal, sané minab mapanglalah langsung ring fisiologi neuronal miwah pamargin urip selami miara disfungsi OXPHOS sané abot. Konsisten sareng hipotesis puniki, iraga manggihin enzim anti-aterosklerotik utama PCx punika kaatur ring duur (Mfn2cKO/CTRL mauwah kirang langkung 1,5 kali; Gambar 3A), sane ngamargiang katalisis konversi piruvat dados oksaloasetat (28), sane kapercayain wenten ring bra, ekspresi to9. 30). Konsisten sareng asil proteomik, mikroskop konfokal nyihnayang ekspresi PCx secara spesifik lan signifikan nincap ring PN sane defisiensi OXPHOS, nanging reaktivitas PCx utamanyane kawatesin ring sel glial Bergmann sane nampek saking kontrol (Gambar 3B). Mangda prasida nguji upregulasi PCx sane katitenin, iraga nambanin irisan serebelum akut antuk [1-13C] pelacak piruvat. Rikala piruvat kaoksidasi olih piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopnyané ical , Nanging karanjingang ring perantara siklus TCA rikala piruvat kametabolisme olih reaksi pembuluh darah (Gambar 3D). Pinaka panunjang data proteomik iraga, iraga ngamatiang akeh penanda saking pelacak puniki ring asam aspartat irisan Mfn2cKO, nanging asam sitrat lan asam malat taler madue tren moderat, yadiastun nenten signifikan (Gambar 3D).
Ring neuron dopamin bikul MitoPark antuk disfungsi mitokondria sane kaawinang olih neuron dopamin khususnyane ngusak-asik gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx taler kaatur secara signifikan (31), nyihnayang indik disfungsi asam aseton du disekurenserosis OXPHOS sane wenten ring angga. Patut kauratiang sampun kapanggihin enzim unik (32-34) sane minab kaekspresiang ring neuron sane minab mapaiketan sareng arteriosklerosis secara signifikan kaatur ring PN sane kirang OXPHOS, sekadi propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonil-CoA mitochilKoA ngubah dados enzim 3 (ME3), sane peran utamanyane inggih punika ngamolihang piruvat saking malat (Gambar 3, A lan C) (33, 35). Tiosan ring punika, iraga manggihin panincapan sane signifikan ring enzim Pdk3, sane fosforilasi lan antuk punika inaktifkan PDH (36), nanging nenten wenten perubahan sane kadeteksi ring enzim Pdp1 sane ngaktifkan PDH utawi kompleks enzim PDH punika (Gambar 3A). Sekadi konsisten, ring PNs Mern2cKO, fosforilasi subunit α1 α (PDHE1α) komponen piruvat dehidrogenase E1 kompleks PDH ring Ser293 (kauningin prasida ngambat aktivitas enzim PDH) katincapang ( Gambar S6C) (Gambar S6). Piruvat nénten madué akses vaskular.
Pamuputnyane, iraga manggihin indik jalur super biosintesis serin lan glisin, siklus mitokondria folat (1C) sane mapaiketan lan biosintesis prolin (Gambar 1G lan Gambar S5C) makasami signifikan up-regulated, manut laporan, salami proses aktivasi. Jaringan sane wenten ring sekitarnyane kaaktifang antuk disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal sane nukung data proteomik puniki nyihnayang ring PN antuk OXPHOS sane kirang, irisan otak bikul sane mayusa 8 minggu keni serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci siklus folat mitokondria. Respon imun sane signifikan (Gambar S5D). Ring 13 irisan serebelum akut sané kainkubasi CU-glukosa, percobaan pelacakan metabolisme salanturnyané nyantenang up-regulasi biosintesis serin miwah prolin, nyihnayang indik fluks isoform karbon dados serin miwah prolin nincap (Gambar S5E). Santukan reaksi sané kapromosiang olih GLS miwah GPT2 madué swadharma ring sintesis glutamat saking glutamin miwah transaminasi pantaraning glutamat miwah α-ketoglutarat, upregulasi ipun nyihnayang neuron sané defisiensi OXPHOS madué panincapan permintaan glutamat , Puniki minab matetujon mangda prasida ngamit panincapan biosintesis proC (Gambar5). Mabinayan sareng pauwahan puniki, analisis proteomik astrosit serebelum saking bikul Mfn2cKO spesifik PN nyihnayang indik jalur puniki (ngranjing makasami antiperoksidase) nenten mauwah signifikan ring ekspresi, punika nyihnayang pengalihan metabolisme puniki selektif ring PN sane kadegradasi ka D (Gambar S6, G).
Cutetnyane, analisis puniki nyihnayang pola aktivasi temporal jalur metabolisme spesifik ring PN sane mabinayan. Yadiastun fungsi mitokondria neuronal sane abnormal prasida ngawinang aterosklerosis ring pangawit lan remodeling 1C (Gambar 3E lan Gambar S5C), lan malah pauwahan sane prasida katebak ring ekspresi kompleks I lan IV, pauwahan sintesis serin de novo wantah Ipun wantah dados kacingak ring tahap pamuput. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E lan Gambar S5C). Temuan puniki negesang proses sané maundagan rikala mitokondria (siklus 1C) miwah sitoplasma (biosintesis serin) sané kamedalang olih stres sané sinarengan antuk nincapnyané aterosklerosis ring siklus TCA mangda prasida ngwentuk malih metabolisme neuronal.
PN sane defisiensi OXPHOS sane mayusa 8 minggu prasida ngamong aktivitas eksitasi frekuensi tinggi lan ngamargiang rekoneksi metabolisme sane signifikan anggen ngimbangi disfungsi mitokondria. Penemuan puniki ngawetuang kemungkinan sane menarik yadiastun ring galahe puniki, sel-sel puniki taler minab Nerima intervensi terapeutik anggen ngandegang utawi nambakin neurodegenerasi. Telat. Iraga muputang minab puniki malarapan antuk kalih intervensi independen. Ring metode kapertama, iraga ngaryanin vektor virus asosiasi adeno (AAV) sane gumantung ring Cre mangda MFN2 prasida kaekspresiang selektif ring PN sane defisiensi OXPHOS in vivo (Gambar S7A). AAV sané nyalin MFN2 miwah gen reporter fluoresen mCherry (Mfn2-AAV) kaverifikasi ring kultur neuron primer in vitro, sané ngawinang MFN2 kaekspresiang antuk pamargi sané gumantung ring Cre miwah nyelametang morfologi mitokondria, punika ngawinang prasida nambakin neuromutasi ring neuron Mfn2, B Gambar S7). Selanturnyane, iraga ngamargiang percobaan in vivo antuk stereotaktik ngirimang Mfn2-AAV sane mayusa 8 minggu ring korteks serebelum Mfn2cKO lan bikul kontrol, lan nganalisis bikul sane mayusa 12 minggu (Gambar 4A). Bikul Mfn2cKO sane karawat padem (Gambar 1, A lan B) (16). Transduksi virus in vivo ngasilang ekspresi selektif PN ring makudang-kudang lingkaran serebelum (Gambar S7, G lan H). Suntikan AAV kontrol sane wantah ngekspresiang mCherry (Ctrl-AAV) nenten madue pengaruh sane signifikan ring tingkat neurodegenerasi ring buron Mfn2cKO. Semaliha, analisis Mfn2cKOs sane katransduksi antuk Mfn2-AAV nyihnayang efek perlindungan sane signifikan saking lapisan sel PN (Gambar 4, B lan C). Secara khusus, kepadatan neuron kacingak meh-mehan nenten prasida kabinayang saking buron kontrol (Gambar 4, B lan C, lan Gambar S7, H lan I). Ekspresi MFN1 nanging nenten MFN2 pateh efektifnyane ring nyelametang kematian neuron (Gambar 4C lan Gambar S7, C lan F), sane nyihnayang ekspresi MFN1 ektopik prasida efektif nyangkepin kakirangan MFN2. Analisis salanturnyane ring tingkat PN tunggal nyihnayang Mfn2-AAV akehnyane nyelametang ultrastruktur mitokondria, normalisasi tingkat mtDNA, lan mabalik ekspresi sane tegeh saking penanda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C ngantos E ). Inspeksi visual bikul Mfn2cKO sane kaselamatang ring kahanan istirahat nyihnayang postur lan gejala motoriknyane (gerakan S1 ngantos S3) sayan nincap. Kesimpulannyane, percobaan puniki nyihnayang indik reintroduksi MFN2 sane katunda ring PN sane defisiensi parah ring OXPHOS cukup anggen ngewaliang konsumsi mtDNA lan ngawinang aterosklerosis, antuk punika prasida nyegah degenerasi akson lan kematian neuron in vivo.
(A) Skema sane nyihnayang jadwal percobaan antuk nyuntikang AAV sane ngkode MFN2 ritatkala jalur metabolisme sane kacihnayang kaaktifang. (B) Gambar konfokal sane ngawakilin irisan otak kecil sane mayusa 12 minggu sane katransduksi ring 8 minggu ring bikul Mfn2cKO lan kadagingin label antuk antibodi anti-Calbindin. Tengen: Skala serat akson. Skala zoom akson inggih punika 450 lan 75 μm. (C) Kiwa: Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje ring loop transduksi AAV (AAV+) (analisis varians satu arah; n = 3 bikul). Tengen: analisis fokus mtDNA ring PN sane katransduksi ring minggu 12 (tes t sane nenten mapasangan; n = 6 sel saking tiga bikul). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mikrograf elektron transmisi perwakilan PN saking bagian otak Mfn2cKO sane katransduksi antuk vektor virus sane kacihnayang. Topeng warna pink ngambarang area sane katempati olih dendrit, lan kotak titik-titik kuning ngambarang zoom sane kasediaang ring sisi tengen; n nyihnayang inti. Palang skala, 1μm. (E) nyihnayang conto pewarnaan PCx ring PN sane katransduksi ring 12 minggu. Palang skala, 20μm. OE, ekspresi sane kalintang; FC, lipet ganti.
Pamuputnyane, iraga nyelehin indik mabuatnyane kelangsungan hidup sel sane kainduksi peroksidase ring PN sane sampun ngarasayang disfungsi OXPHOS. Iraga ngasilang mCherry sane nyalin AAV-shRNA (RNA jepit rambut cendet) sane khusus kaaptiang mRNA PCx bikul (AAV-shPCx), taler nyuntikang virus utawi kontrol sane kaacak (AAV-scr) ring otak bikul Mfn2cKO. Suntikan kalaksanayang ring minggu kaping pat yusa (Gambar 5A) mangda ngamolihang knockdown PCx sane efektif ring periode rikala ekspresi PCx nincap (Gambar 3C) lan lapisan sel PN kantun utuh (Gambar 1A). Patut kauratiang yening ngrusak PCx (Gambar S8A) ngawinang percepatan kematian PN sane signifikan, sane kawatesin ring ring sane keni infeksi (Gambar 5, B lan C). Mangda prasida ngresepang mekanisme efek metabolisme sane kainduksi olih PCx up-regulation, iraga malajahin status redoks PN sesampun knockdown PCx lan biosensor optik sane kamediasi AAV Grx1-roGFP2 kaekspresiang sinarengan (Gambar S8, B ngantos D) anggen ngevaluasi glutasion peptida relatif8). Raris, iraga ngamargiang mikroskop pencitraan seumur hidup fluoresensi kalih foton (FLIM) ring irisan otak akut Mfn2cKO sane mayusa 7 minggu utawi kontrol littermates anggen mendeteksi potensi perubahan status redoks sitoplasma sesampun ngeverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E ngantos G). Analisis nyihnayang panincapan sane signifikan ring kahanan oksidasi PN Mfn2cKO tunggal sane kirang ekspresi PCx, sane mabinayan sareng neuron kontrol utawi PN Mfn2cKO sane wantah ngekspresiang shRNA sane kaacak (Gambar 5, D lan E). Rikala ekspresi PCx karegulasi, persentase PN Mfn2cKO sané nyihnayang kahanan sané banget teroksidasi nincap lintangan saking tigang kalih (Gambar 5E), nyihnayang indik PCx up-regulation miara kapasitas redoks neuron sané degenerasi.
(A) Skema sane nyihnayang jadwal percobaan antuk nyuntikang AAV sane ngkode shPCx ritatkala jalur metabolisme sane kacihnayang kaaktifang. (B) Foto konfokal representatif saking bagian otak kecil sane mayusa 8 minggu ring bikul Mfn2cKO sane katransduksi lan kadagingin label antuk antibodi anti-kalsineurin ring 4 minggu. Palang skala, 450μm. (C) Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje ring loop sane katransduksi AAV (analisis varians satu arah; n = 3 ngantos 4 bikul). Data sane kacihnayang antuk rata-rata±SEM; ***P<0,001. (D) Gambar FLIM representatif nyihnayang rata-rata masa hidup PN sane mayusa 7 minggu sane ngekspresiang sensor redoks glutation Grx1-roGFP2 ring kondisi percobaan sane sampun katentuang. Rasio LUT (tabel sane kacingak): interval galah kauripan (ring pikodetik). Palang skala, 25μm. (E) Histogram nyihnayang distribusi nilai masa hidup Grx1-roGFP2 saking (D) (n=158 ngantos 368 sel ring kalih bikul ring soang-soang kondisi). Bagan pai ring baduur soang-soang histogram: nyihnayang akeh sel sane madue nilai masa hidup sane signifikan langkung (merah, teroksidasi) utawi cendet (biru, berkurang), sane nglintangin 1 SD saking nilai masa hidup rata-rata ring CTRL-AAV-scr. (F) Model sane kaunggahang nyihnayang efek perlindungan saking upregulasi PCx neuronal.
Samian punika, data sane kaicenin iraga iriki nyihnayang indik re-ekspresi MFN2 prasida jangkep nyelametang PN sane sampun lanjut antuk defisiensi OXPHOS sane parah, depletion mtDNA sane parah, lan morfologi mirip ista sane sanget abnormal, antuk punika ngicenin kemajuan sane terus-menerus yadiastun ring penyakit sane sampun lanjut. Neurodegenerasi ngicénin bukti sané prasida kabalikang saking undagan sadurung sel padem. Tingkat fleksibilitas metabolisme puniki salanturnyane katekanin olih kawagedan neuron mangda prasida ngawinang aterosklerosis (rewiring siklus TCA), sane ngambat ekspresi PCx ring PN sane kirang OXPHOS lan nincapang kematian sel, punika mawinan maplalian peran perlindungan (Gambar 5F).
Ring tetilikan puniki, iraga ngicenin bukti indik respons PN majeng ring disfungsi OXPHOS inggih punika saka kidik konvergen ring aterosklerosis siklus TCA malarapan antuk jalur aktivasi diferensial sane kaaktifang olih program metabolisme. Iraga ngukuhang analisis proteomik antuk makudang-kudang metode komplementer miwah nyihnayang rikala katantang olih disfungsi mitokondria sané abot, neuron madué wentuk elastisitas metabolisme sané durung kauningin sadurungnyané. Sane ngawinang iraga angob, makasami proses rewiring nenten pastika nyihnayang kahanan metabolisme terminal sane nyarengin neurodegenerasi saka kidik lan nenten prasida kabalikang, nanging data iraga nyihnayang indik punika minab dados neuron pemeliharaan yadiastun ring tahap sadurung sel padem Mekanisme kompensasi fungsional. Pikolih puniki nyihnayang neuron madué undagan plastisitas metabolisme sané ageng ring angga. Fakta puniki nyihnayang indik reintroduksi MFN2 salanturnyane prasida mabalik ekspresi penanda metabolisme kunci lan nyegah degenerasi PN. Tungkalikannyane, punika ngambat aterosklerosis lan ngelisang saraf. sane transeksual.
Silih tunggil pikolih sané pinih becik ring seseleh iraga inggih punika PN sané nénten madué OXPHOS prasida nguwah metabolisme siklus TCA antuk ngatur enzim sané khusus ngawinang arteriosklerosis. Penataan ulang metabolisme inggih punika cecirén sané katah ring sel kanker, makudang-kudang sané ngandelang glutamin mangda prasida nyangkepin perantara siklus TCA mangda prasida ngasilang ekuivalen reduksi, sané nyokong rantai pernapasan miwah miara produksi prekursor biosintesis lipid miwah nukleotida (39 , 40). Seseleh sane anyar nyihnayang ring jaringan perifer sane ngarasayang disfungsi OXPHOS, rekoneksi metabolisme glutamin/glutamat taler dados fitur sane menonjol (5, 41), ring dija arah ngranjingnyane glutamin ring siklus TCA gumantung ring Krana parahnyane tatu OXPHOS (41). ). Nanging, kirang wenten bukti sane jelas indik napi kemanten sane pateh saking plastisitas metabolisme neuronal ring angga lan minab relevansinyane ring konteks penyakit. Ring panyelehan in vitro sané anyar, neuron kortikal primer mabukti prasida ngamargiang kolam glutamat ring neurotransmisi, punika ngawinang prasida nincapang metabolisme oksidatif miwah aterosklerosis ring tengahing kahanan stres metabolisme (42). Patut kauratiang yening ring sor inhibisi farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat kapercayain prasida ngajegang sintesis oksaloasetat ring neuron granul serebelum sane kabudidaya (34). Nanging, relevansi fisiologis mekanisme puniki ring jaringan otak (ring dija aterosklerosis kaprecaya utamanyane kawatesin ring astrosit) kantun madue signifikansi fisiologis sane mabuat (43). Ring kahanan puniki, data iraga nyihnayang PN sane karusak olih OXPHOS ring angga prasida kagentosin dados degradasi BCAA lan karboksilasi piruvat, sane dados kalih sumber utama suplementasi perantara kolam TCA. Yadiastun kontribusi sané katenger saking katabolisme BCAA ring metabolisme energi neuron sampun kausulang, tiosan ring peran glutamat miwah GABA ring neurotransmisi (44), kantun nénten wénten bukti indik mekanisme puniki ring vivo. Punika mawinan, dangan antuk maspekulasi yening PN sane disfungsional prasida otomatis ngimbangi konsumsi perantara TCA sane kasokong olih proses asimilasi antuk nincapang aterosklerosis. Untengnyané, upregulasi PCx minab kaperluang mangda prasida ngamit nincapnyané pinunas asam aspartat, sané kasaratang ring proliferasi sel antuk disfungsi mitokondria (45). Nanging, analisis metabolomik iraga nenten nyihnayang pauwahan sane signifikan ring tingkat steady-state asam aspartat ring Mfn2cKO PNs (Gambar S6A), sane minab nyihnayang pemanfaatan metabolisme asam aspartat sane mabinayan pantaraning sel proliferasi lan neuron pasca-mitosis . Yadiastun mekanisme sané pastika saking upregulasi PCx ring neuron disfungsional in vivo kantun kacihnayang, iraga nyihnayang indik respons prematur puniki mabuat pisan rikala miara kahanan redoks neuron, sané kacihnayang ring percobaan FLIM ring irisan serebelum. Untengnyane, nambakin PN saking up-regulating PCx prasida ngawinang kahanan sane sayan teroksidasi lan ngelisang sel sane padem. Aktivasi degradasi BCAA lan karboksilasi piruvat nenten ja cara sane kaanggen ngaciriang jaringan perifer disfungsi mitokondria (7). Punika mawinan, ipun kacingak dados fitur prioritas neuron sane defisiensi OXPHOS, yadiastun nenten wantah fitur punika, sane mabuat majeng ring neurodegenerasi. .
Penyakit serebelum inggih punika soroh penyakit neurodegeneratif sane heterogen sane biasane kacihnayang antuk ataksia lan sering ngrusak PN (46). Populasi neuron puniki banget dangan keni disfungsi mitokondria santukan degenerasi selektif ipun ring bikul prasida ngamedalang akéh gejala motorik sané dados cecirén ataksia spinoserebellar manusa (16, 47, 48). Manut laporan, model bikul transgenik antuk gen mutan mapaiketan sareng ataksia spinoserebellar manusa taler madue disfungsi mitokondria (49, 50), sane negesang mabuat pisan malajahin konsekuensi defisiensi OXPHOS ring PNPH. Punika mawinan, utamannyane cocok anggen ngisolasi lan malajahin populasi neuron sane unik puniki antuk efektif. Sakéwanten, santukan PN banget sensitif ring tekanan miwah nlatarang proporsi sané alit saking makasami populasi sel serebelum, ring akéh panyelehan sané madasar antuk omics, pamisahan selektif saking makasami sel kantun dados aspek sané nantangin. Yadiastun meh-mehan nenten prasida ngamolihang kirangnyane kontaminasi mutlak saking soroh sel tiosan (utaminnyane jaringan dewasa), iraga ngapukang pidabdab disosiasi sane efektif sareng FACS mangda ngamolihang akeh neuron sane layak anggen analisis proteomik hilir, lan madue cakupan protein sane cukup tinggi (kirang langkung 3000 the cerebel) (51). Antuk nglestariang viabilitas sel-sel sane jangkep, metode sane iraga sediaang iriki ngawinang iraga nenten wantah prasida nyelehin pauwahan jalur metabolisme ring mitokondria, nanging taler prasida nyelehin pauwahan ring rekan-rekan sitoplasmanyane, sane nyangkepin kawigunan tag membran mitokondria ring jenis sel number the new metho of michond (52, 53). Metode sane katlatarang iraga nenten wantah mapaiketan sareng studi sel Purkinje, nanging prasida dangan kaanggen ring soroh sel napi kemanten anggen nanganin perubahan metabolisme ring otak sane keni gering, rumasuk model disfungsi mitokondria sane lianan.
Pamuputnyané, iraga sampun ngidentifikasi jendela terapeutik selami proses penataan ulang metabolisme puniki sané prasida jangkep ngwaliang cihna-cihna kunci stres seluler miwah nyegah degenerasi neuron. Punika mawinan, ngresepang implikasi fungsional saking rewiring sané katlatarang iriki prasida ngicénin wawasan dasar indik minab perawatan mangda prasida miara viabilitas neuronal selami disfungsi mitokondria. Penelitian sane jagi rauh sane matetujon anggen membedakan perubahan metabolisme energi ring jenis sel otak sane lianan kabuatang anggen jangkep ngungkapang penerapan prinsip puniki ring penyakit neurologis sane lianan.
Bikul MitoPark sampun katlatarang sadurungnyane (31). Bikul C57BL/6N antuk gen Mfn2 sane ngapit loxP sampun katlatarang sadurungnyane (18) lan kasilang sareng bikul L7-Cre (23). Progeny heterozigot ganda sane kapolihang raris kasilang sareng bikul homozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP anggen ngasilang knockout gen spesifik Purkinje anggen Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ring subset pawiwahan, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) kasobyahang saking persilangan tambahan (20). Makasami pidabdab ring buron kamargiang manut ring tata titi Eropa, nasional miwah lembaga taler sampun kacumpuin olih LandesamtfürNatur saking Umwelt miwah Verbraucherschutz, Rhina Utara-Westphalia, Jerman. Pakaryan ring buron taler nganutin tuntunan saking Asosiasi Federasi Ilmu Buron Laboratorium Eropa.
Sesampune kabius dislokasi serviks anak istri sane mobot, embrio bikul kaisolasi (E13). Korteks kabedah ring Larutan Uyah Seimbang Hanks (HBSS) sane kawewehin antuk Hepes 10 mM lan katedunang ring Media Elang Modifikasi Dulbecco sane madaging papain (20 U/ml) lan sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan ring DMEM) lan disosiasiang antuk pencernaan enzimatik. Ml) ring suhu 37°C salami 20 menit, lan salanturnyane kagiling antuk mekanis ring DMEM sane kawewehin antuk 10% serum sapi janin. Sel-sel punika katanem ring coverslip kaca sane kalapisin antuk polilisin antuk kepadatan 2×106 per piring kultur 6 cm utawi antuk kepadatan 0,5×105 sel/cm2 anggen analisis pencitraan. Sesampune 4 jam, media kagentosin antuk media bebas serum Neurobasal sane madaging suplemen B27 1% lan GlutaMax 0,5 mM. Neuron raris kapertahanin ring suhu 37°C miwah 5% CO2 selami percobaan, miwah kaicenin amah-amahan awuku apisan. Mangda prasida ngawinang rekombinasi in vitro, 3 μl (piring kultur 24 sumur) utawi 0,5 μl (piring 24 sumur) saking vektor virus AAV9 sekadi ring sor puniki kawigunayang anggen nambanin neuron ring rahina kaping kalih in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgen, nomor katalog 105530-AAV9) miwah AAV9.
DNA pelengkap bikul Mfn1 miwah Mfn2 (kapolihang saking plasmid Addgene #23212 miwah #23213, soang-soang) kacihnayang antuk undagan V5 (GKPIPNPLLGLDST) ring muncuk C, taler masikian sareng mCherry ring bingkai majalaran antuk undagan T2A. Grx1-roGFP2 inggih punika hadiah saking Heidelberg TP Dick DFKZ (Pusat Penelitian Kerembaan Jerman). Antuk ngentosin kaset tdTomato ngawigunayang tata cara kloning konvensional, kaset punika kasubkloning ring tulang tundun pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomor referensi Addgene 28306) anggen ngasilang pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato. Vektor FLEX-mCeri-T2A-MFN1-V5 miwah pAAV-CAG-FLEX-Grx-RoGFP2. Pidabdab sane pateh kawigunayang anggen ngasilang vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Mangda prasida ngasilang konstruksi AAV-shPCx, vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA # 1]) kabuatang, sane madaging urutan DNA sane ngranjingang kode shRNA sane kaaptiang PCx bikul (5′ 3′) Ring sor kontrol promotor U6, mCherry kaanggen ring sor kontrol promotor CMV. Produksi vektor AAV bantu puniki kamargiang manut ring pituduh pabrikan (Cell Biolabs). Cutetnyane, nganggen plasmid transfer sane makta mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) secara transien-Tranfeksi sel 2900. gen pengkodean gen, taler pengkodean protein kapsid AAV1 lan protein aksesoris Plasmid kemasan, nganggen metode kalsium fosfat. Supernatan virus kasar kapolihang antuk siklus beku-cair ring pemandian es kering/etanol lan sel-sel sane kalisis ring saline penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV kamurniang antuk ultrasentrifugasi gradien yodiksanol sane nenten kalanturang (24 jam ring 32.000 rpm lan 4°C) lan kakonsentrasiang nganggen filter sentrifugal Amicon ultra-15. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 salinan genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX sane kaukur antuk galah sane nyata, kaukur sekadi sadurungnyane. (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 x 1013 GC/ml) miwah AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml) sane sampun kasurat ring ajeng.
Neuron primer kagetep ring PBS 1x dingin es, kapelet, lan salanturnyane kahomogenisasi ring 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolat/penyangga lisis PBS sane madaging fosfatase lan inhibitor protease (Roche). Kuantifikasi protein kamargiang antuk ngawigunayang assay asam bisinkoninat (Thermo Fisher Ilmiah). Protein raris kapasahang antuk elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, raris kapuputang ring membran poliviniliden fluorida (GE Healthcare). Blokir genah sane nenten spesifik lan inkubasi antuk antibodi primer (cingak Tabel S1 antuk rincian) ring susu 5% ring TBST (saline penyangga Tris antuk Tween), langkah-langkah ngumbah lan antibodi sekunder ring TBST Inkubasi. Inkubasi antuk antibodi primer semeng ring suhu +4°C. Sesampune kacuci, antibodi sekunder punika kagenahang salami 2 jam ring suhu kamar. Selanturnyane, antuk inkubasi blot sane pateh antuk antibodi anti-β-aktin, muatan sane pateh kakonfirmasi. Deteksi antuk nguwah dados kemiluminesens lan nincapang kemiloluminesens (GE Healthcare).
Neuron sadurungnyane kagenahang ring coverslip kaca kagenahang antuk 4% paraformaldehida (PFA)/PBS ring titik galah sane sampun katentuang ring suhu kamar salami 10 menit. Penutup kapertama karesep antuk 0,1% Triton X-100/PBS salami 5 menit ring suhu kamar, lan salanturnyane ring penyangga pemblokiran [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Ring rahina kaping kalih, coverslips kacuci antuk penyangga pemblokiran lan kainkubasi antuk antibodi sekunder konjugasi fluorofor sane patut salami 2 jam ring suhu kamar; pamuputnyane, sampel kacuci becik-becik ring PBS antuk 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) sane kawarnain lan salanturnyane kagenahang ring slide mikroskop antuk Aqua-Poly/Mount.
Bikul (lanang lan istri) kaanestesi antuk suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) lan xilazin (10 mg/kg) lan kaicenin ring subkutan antuk analgesik karprofen (5 mg/kg) , Lan kagenahang ring instrumen stereotaktik (Kopd a) antuk peralatan war. Ekspos tengkorak lan nganggen bor gigi anggen menipiskan bagian korteks serebelum sane manut sareng tulang mis (saking lambda: ikuh 1,8, lateral 1, manut sareng lobus IV lan V). Anggen jaum jarum suntik sane melengkung mangda becik-becik ngaryanin bolong alit ring tengkorak mangda nenten ngrusak pembuluh darah ring sor. Raris kapiler kaca sane kagambar tipis punika alon-alon kagenahang ring lubang mikro (saking -1,3 ngantos -1 ring sisi ventral dura mater), lan 200 ngantos 300 nl AAV kasuntikang ring mikro-injektor (Narishige) antuk jarum suntik manual (Narishige tisure) periode tekanan several1. jendela menit. Sesampune infus, genahang kapiler malih 10 menit mangda virus punika prasida nglimbak jangkep. Sesampune kapiler punika kacabut, kulitnyane kajahit becik-becik mangda ngirangin radang tatu lan ngawinang buron punika prasida seger. Buron punika karawat antuk analgesik (caspofen) makudang-kudang rahina sesampun operasi, salami punika kahanan fisiknyane kapantau becik-becik lan salanturnyane ipun kaeutanasia ring titik galah sane sampun katelatarang. Makasami tata cara puniki kamargiang manut ring tata titi Eropa, nasional miwah kelembagaan taler sampun kacumpuin olih LandesamtfürNatur saking Umwelt miwah Verbraucherschutz, Rhina Utara-Westfalia, Jerman.
Buron punika kaanestesi antuk ketamin (100 mg/kg) lan xilazin (10 mg/kg), lan jantung kaperfusi antuk PBS 0,1 M kapertama, lan selanturnyane antuk PFA 4% ring PBS. Jaringan punika kabedah lan kagenahang ring 4% PFA/PBS semeng ring suhu 4°C. Pisau sane magetar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) kaanggen nyiagayang pahan sagital (tebelnyane 50 μm) saking otak sane tetep ring PBS. Sajabaning wenten sane sampun katentuang, pewarnaan bagian-bagian sane ngambang bebas kalaksanayang sakadi sane sampun katlatarang ring ajeng (13) ring suhu kamar lan kaaduk. Cutetnyane, kapertama, irisan sane kapolihang kapermeabilisasi antuk 0,5% Triton X-100/PBS salami 15 menit ring suhu kamar; antuk makudang-kudang epitope (Pcx lan Shmt2), antuk ring penyangga tris-EDTA ring suhu 80°C (PH 9) manasin irisan salami 25 menit gumanti langkah puniki. Selanturnyane, pahan-pahan punika kainkubasi antuk antibodi primer (cingak Tabel S1) ring penyangga pemblokiran (3% BSA/PBS) ring suhu 4°C semeng antuk kaaduk. Benjangnyane, bagian-bagian punika kacuci antuk penyangga pemblokiran lan kainkubasi antuk antibodi sekunder konjugasi fluorofor sane patut salami 2 jam ring suhu kamar; pamuputnyane, pahan-pahan punika kacuci becik-becik ring PBS, kawarnain antuk DAPI, lan salanturnyane kagenahang antuk AquaPolymount Ring slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X utawi Lembar Cahaya Digital TCS, Mikrosistem Leica) sane kalengkapin antuk laser cahaya putih lan laser ultraviolet 405 dioda kaanggen nyimpen gambar sampel. Antuk ngawinang fluorofor miwah mupulang sinyal antuk Detektor Hibrida (HyDs), perangkat lunak LAS-X kawigunayang anggen mupulang gambar sane matumpuk manut sareng pengambilan sampel Nyquist ring mode berurutan: antuk panel non-kuantitatif, punika sinyal sane pinih dinamis (minakadi, ring sel somatik miwah dendrit) mt Mode TerangR). Gating saking 0,3 ngantos 6 ns kaanggen ngirangin latar belakang.
Pencitraan galah nyata saking sel sané kasorohang. Sesampune kasorohang ring media Neurobasal-A sane madaging suplemen B27 1% lan GlutaMax 0,5 mM, sel-sel langsung kagenahang ring slide kaca sane malapis poli-l-lisin (μ-Slide8 Nah, Ibidi, nomor katalog 80826) , Lan selanturnyane kasimpen ring suhu 1% CO lan 300 mM. mangda prasida meneng. Pencitraan galah nyata kamargiang ring mikroskop konfokal pemindaian laser Leica SP8 sane kadagingin antuk lensa objektif minyak laser putih, HyD, 63×[1,4 bukaan numerik (NA)] miwah panggung pemanasan.
Bikul gelis kaanestesi antuk karbondioksida lan kagetep, otak gelis kaicalang saking tengkorak, lan kagetep dados tebel 200μm (anggen percobaan pelabelan Fi3C) utawi tebel 275μm (anggen percobaan kalih foton) bagian sagital sane kadagingin antuk bahan crece TheHr-5M i6 Ilmiah, Walldorf, Jerman) kadagingin antuk zat-zat sekadi ring sor puniki: 125 mM dingin es, jenuh karbon (95% O2 lan 5% CO2) Ca2 sane rendah + cairan tulang belakang otak buatan (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium m32, 1,25 mM natrium fos2. glukosa, CaCl2 0,5 mM lan MgCl2 3,5 mM (tekanan osmotik 310 ngantos 330 mmol). Transfer irisan otak sane kapolihang ka ruang pra-inkubasi sane madaging Ca2 + ACSF sane tegehan (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa m2C, 15,0 mM d-glukosa). MgCl2) Sedeng) sane pHnyane 7,4 lan 310 ngantos 320 mmol).
Selami proses pencitraan, irisan kagingsirang ring ruang pencitraan khusus, lan percobaan kamargiang ring sor perfusi ACSF sane terus-menerus ring suhu konstan 32° kantos 33°C. Mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Mikrosistem Leica) sane kadagingin antuk lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, toya), laser Ti: Safir (Visi Bunglon II, Koheren) kawigunayang anggen pencitraan irisan. Modul FLIM (PikoHarp300, PikoKuant).
FLIM saking grx1-rogfp2. Pauwahan kahanan redoks sitoplasma PN kaukur antuk FLIM kalih foton ring irisan otak sagital, ring dija biosensor Grx1-roGFP2 kaaptiang PN. Ring lapisan PN, medan akuisisi kapilih sawatara 50 ngantos 80 μm ring sor permukaan irisan mangda prasida mastikayang wenten PN sane layak (inggih punika, kirangnyane struktur manik-manik utawi perubahan morfologis neuronal ring salantang dendrit) lan sensor roGFP2 positif ganda lan pengkodean PCx iRNA sh mCeri). Mupulang gambar tumpukan tunggal antuk zoom digital 2x [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: HyD internal, kelompok filter fluoresein isotiosianat (FITC)] lan rata-rata gambar ring 2 ngantos 3 menit kaanggen mastikayang foton sane cukup kapupulang (1000 foton makasami) anggen pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 miwah verifikasi kahanan FLIM kamargiang antuk ngawasin nilai masa hidup roGFP2 rikalaning ngawewehin H2O2 eksogen 10 mM ring perfusi ACSF (mangda prasida nincapang oksidasi, ngasilang degreemithol saking reduksi, ngawinang wenten panurunan masa hidup) (Gambar S8, D ngantos G). Ngawigunayang piranti lunak FLIMfit 5.1.1 anggen nyelehin pikolih sane kapolihang, pas kurva peluruhan eksponensial tunggal saking makasami gambar majeng ring IRF sane kaukur (fungsi respons instrumen), lan χ2 inggih punika kirang langkung 1. Anggen ngitung masa hidup topeng tunggal lan masa hidup topeng punika manual ring sekitar saraf a sane kaanggen ring kuantifikasi.
Panyelehan potensi mitokondria. Risampune pahan akut kainkubasi antuk TMRM 100 nM langsung kawewehin ring ACSF sane kaperfusi salami 30 menit, pauwahan potensial mitokondria PN kaukur antuk mikroskop kalih foton. Pencitraan TMRM kamargiang antuk ngeksitasi probe ring 920 nm lan nganggen HyD internal (tetrametilrodamin isotiosianat: 585/40 nm) anggen mupulang sinyal; antuk nganggen panjang gelombang eksitasi sane pateh nanging nganggen HyD internal sane matiosan (FITC :525/50) anggen nyimpen mtYFP. Anggén plug-in Kalkulator Gambar ImageJ anggén nyelehin potensi mitokondria ring undagan sel tunggal. Cutetnyane, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) kaanggen ngidentifikasi wewidangan mitokondria sane nyihnayang sinyal TMRM ring Purkinje Somali ring gambar konfokal tumpukan tunggal saluran sane anut. Raris area piksel ring masker sane kapolihang kaukur, lan salanturnyane kanormalisasi ring gambar tumpukan tunggal ambang batas sane anut saking saluran mtYFP mangda ngamolihang fraksi mitokondria sane nyihnayang potensi mitokondria.
Gambar punika kadekonvolusi antuk perangkat lunak Huygens Pro (Pencitraan Volume Ilmiah). Antuk gambar ubin sane ka-scan, montase ubin tunggal kakaryanin nganggen algoritma jahitan otomatis sane sampun kasediaang olih piranti lunak LAS-X. Sesampune kalibrasi gambar, nganggen ImageJ lan Adobe Photoshop anggen ngolah gambar salanturnyane lan seragam nyesuaiang kecerahan lan kontras. Anggén Adobe Ilustrator anggén nyiagayang grafis.
Analisis sane fokus ring mtDNA. Akeh lesi mtDNA kaukur ring pahan serebelum sane kadagingin label antuk antibodi majeng ring DNA antuk mikroskop konfokal. Soang-soang area sasaran kakaryanin antuk awak sel lan inti soang-soang sel, lan area soang-soang kaitung nganggen plug-in Multi Measure (perangkat lunak ImageJ). Kirangin area inti saking area awak sel mangda ngamolihang area sitoplasma. Pamuputnyane, plug-in Analyze Particles (perangkat lunak ImageJ) kaanggen antuk otomatis ngukur titik DNA sitoplasma sane nyihnayang mtDNA ring gambar ambang batas, lan pikolih sane kapolihang kanormalisasiang antuk rata-rata PN bikul CTRL. Pikolihnyane kacihnayang pinaka akeh rata-rata nukleosida per sel.
Panyelehan indik ekspresi protein. Anggen plug-in Kalkulator Gambar ImageJ anggen ngevaluasi ekspresi protein ring PN ring tingkat sel tunggal. Cutetnyane, ring gambar konfokal lapisan tunggal saluran sane anut, malarapan antuk persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), wewidangan mitokondria sane nyihnayang imunoreaktivitas majeng ring antibodi tertentu ring Purkina kaidentifikasi. Raris area piksel ring masker sane kapolihang kaukur, lan salanturnyane kanormalisasi ring gambar tumpukan tunggal ambang batas sane anut saking saluran mtYFP mangda ngamolihang fraksi mitokondria saking protein sane kasinahang.
Analisis kepadatan sel Purkinje sane sampun kalaksanayang. Plug-in Cell Counter saking ImageJ kaanggen antuk ngevaluasi kepadatan Purkinje antuk ngepah jumlah sel Purkinje sane kaitung antuk panjang cincin otak sane katempati olih sel sane kaitung.
Persiapan miwah mupulang conto. Otak saking kelompok kontrol lan bikul Mfn2cKO kagenahang ring 2% PFA/2,5% glutaraldehida ring penyangga fosfat 0,1 M (PB), lan selanturnyane bagian koronal kasiagayang nganggen siliat (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Ketebalan penyangga fix μm1 o% The60). tetraoksida lan 1,5% kalium ferosianida ring suhu kamar salami 1 jam. Pahan-pahan punika kacuci ping tiga antuk toya suling, lan salanturnyane kawarnai antuk etanol 70% sane madaging 1% uranil asetat salami 20 menit. Pahan-pahan punika raris kadehidrasi ring alkohol sane katingkatin taler kagenahang ring resin epoksi Durcupan ACM (resin pengecoran Araldite M) (Ilmu Mikroskopi Elektron, nomor katalog 14040) pantaraning slide kaca sane malapis silikon, taler pamuputnyane ring suhu 60 °C Polimerisasi ring oven48. Wewidangan korteks otak kecil kapilih lan kepahan ultratipis 50 nm katebas ring Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) lan kapilih ring kisi celah tembaga 2×1 mm sane kalapisin antuk film polistirena. Pahan-pahan punika kawarnai antuk larutan 4% uranil asetat ring H2O salami 10 menit, kacuci antuk H2O makudang-kudang kali, salanturnyane antuk sitrat timah Reynolds ring H2O salami 10 menit, lan salanturnyane kacuci antuk H2O makudang-kudang kali. Mikrograf kaambil antuk mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Ilmiah, Waltham, MA, AS) nganggen kamera digital TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, AS). Jerman).
Antuk bikul sane keni AAV, otak kapasahang lan kairis dados bagian sagital sane tebelnyane 1 mm, lan serebelum katureksa nganggen mikroskop fluoresensi anggen ngidentifikasi cincin sane keni AAV (inggih punika, mCherry ekspresi). Wantah percobaan ring dija suntikan AAV ngasilang efisiensi transduksi sane pinih tegeh saking lapisan sel Purkinje (inggih punika meh-mehan makasami lapisan) ring paling kidik kalih cincin serebelum sane berturut-turut sane kaanggen. Loop sane katransduksi AAV ka-mikrodiseksi anggen pasca-fiksasi semeng (4% PFA lan 2,5% glutaraldehida ring penyangga kakao 0,1 M) lan kaproses salanturnyane. Antuk penyematan EPON, jaringan tetep kacuci antuk penyangga kakao natrium 0,1 M (Applichem), lan kainkubasi antuk 2% OsO4 (os, Layanan Sains; Caco) ring penyangga kakao natrium 0,1 M (Applichem) 4 Jam, salanturnyane kacuci salami 2 jam. Wawanin 3 kali antuk penyangga cocamide 0,1 M. Selanturnyane, seri etanol sane menek kawigunayang anggen inkubasi soang-soang larutan etanol ring suhu 4 °C salami 15 menit anggen dehidrasi jaringan. Jaringan punika kagingsirang ring propilen oksida taler kainkubasi semeng ring EPON (Sigma-Aldrich) ring suhu 4°C. Genahang jaringan ring EPON seger ring suhu kamar salami 2 jam, lan salanturnyane selemang ring suhu 62°C salami 72 jam. Ngawigunayang ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) miwah pisau berlian (Diatome, Biel, Swiss) anggen ngetepang pahan ultratipis 70 nm, taler noda antuk uranil asetat 1,5% salami 15 menit ring suhu 37 °C, taler noda antuk larutan timah sitrat 4 menit. Mikrograf elektron kaambil nganggen mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) sane kalengkapin antuk kamera OneView 4K 16-bit (Gatan) lan perangkat lunak DigitalMikrograf (Gatan). Antuk analisis, mikrograf elektron kapolihang antuk zoom digital 5000× utawi 10.000×.
Analisis morfologis ring mitokondria. Antuk makasami analisis, kontur mitokondria individu kagambar manual ring gambar digital ngawigunayang perangkat lunak ImageJ. Parameter morfologis sane mabinayan sane kaselehin. Kepadatan mitokondria kacihnayang pinaka persentase sane kapolihang antuk ngepah luas mitokondria total soang-soang sel antuk luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas inti sel) × 100. Kebulatan mitokondria kaitung antuk rumus [4π∙2(luas)]./perimeter. Morfologi ista mitokondria kaanalisis lan kakepah dados kalih kategori (“tubular” lan “lepuh”) manut wentuk utamanyane.
Analisis jumlah autofagosom/lisosom miwah kepadatan. Ngawigunayang piranti lunak ImageJ antuk manual ngambar kontur soang-soang autofagosom/lisosom ring gambar digital. Area autofagosom/lisosom kacihnayang pinaka persentase sané kaitung antuk ngepah area struktur autofagosom/lisosom total saking soang-soang sel antuk area sitoplasma (area sitoplasma=area sel-area inti)×100. Kepadatan autofagosom/lisosom kaitung antuk ngepah jumlah total antuk jumlah struktur autofagosom/lisosom per sel (ring segi area sitoplasma) (area sitoplasma = area sel-area inti).
Pelabelan antuk seksi akut lan persiapan sampel. Antuk percobaan sane ngamerluang pelabelan glukosa, pindahang irisan otak akut ring ruang pra-inkubasi, sane madaging karbon jenuh (95% O2 lan 5% CO2), Ca2 + ACSF sane tegeh (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium fosfat, 1,25 mM natrium fosfat. 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 lan 2,0 mM MgCl 2, kasesuaiang sareng pH 7,4 lan 310 ngantos 320 mOsm), ring dija glukosa inggih punika 13 C 6- Substitusi glukosa (Eurisotop, nomor katalog63-1). Antuk percobaan sane ngamerluang pelabelan piruvat, pindahang irisan otak akut ring Ca2 + ACSF sane tegehan (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa Ad.2M lan100 mM). MgCl2, kasesuaiang sareng pH 7,4 lan 310 ngantos 320mOsm), lan kawewehin 1mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi bagian-bagian punika salami 90 menit ring suhu 37°C. Ring panguntat percobaan, pahan-pahan punika gelis kacuci antuk larutan berair (pH 7,4) sane madaging amonium karbonat 75 mM, lan salanturnyane kahomogenisasi ring 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: toya. Risampune pahan-pahan punika kainkubasi ring es salami 30 menit, sampel kasentrifugasi ring 21.000 g salami 10 menit ring suhu 4°C, lan supernatan bening kakering ring konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit kering sane kapolihang kasimpen ring suhu -80°C kantos kaanalisis.
Analisis spektrometri massa kromatografi cair saking 13 asam amino sane madaging label C. Antuk analisis spektrometri massa kromatografi cair (LC-MS), pelet metabolit kasuspensi malih ring 75 μl toya kelas LC-MS (Honeywell). Risampune sentrifugasi ring 21.000 g salami 5 menit ring suhu 4°C, 20 μl supernatan sane sampun kaklarifikasi kaanggen analisis fluks asam amino, nanging sisa ekstrak langsung kaanggen analisis anion (cingak ring sor). Analisis asam amino kamargiang nganggen protokol derivatisasi benzoil klorida sane sampun katlatarang sadurungnyane (55, 56). Ring pamargi kapertama, 10 μl natrium karbonat 100 mM (Sigma-Aldrich) kawewehin antuk 20 μl ekstrak metabolit, lan salanturnyane 10 μl benzoil klorida 2% (Sigma-Aldrich) kawewehin ring ACN kelas LC. Sampel kavorteks akidik raris kasentrifugasi ring 21.000 g salami 5 menit ring suhu 20°C. Pindahang supernatan sane sampun kabersihin ring vial autosampler 2 ml antuk sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel sane kaanalisis nganggen sistem LC kinerja ultra-tinggi Acquity iClass (Toya) sane kasambungang sareng spektrometer massa presisi resolusi tinggi Q-Eksaktif (QE)-HF (Orbit Medan Ultra Tinggi) (Thermo Fisher Scientific). Antuk analisis, 2μl saking sampel turunan kasuntikang ring kolom silika T3 kekuatan tinggi 100×1,0 mm (Waters) sane madaging partikel 1,8μm. Laju alirannyane inggih punika 100μl/menit, lan sistem penyangga kawangun antuk penyangga A (10 mM amonium format lan 0,15% asam formik ring toya) lan penyangga B (ACN). Gradiennyane sakadi ring sor puniki: 0%B ring 0 menit; 0%B. 0 ngantos 15% B ring 0 ngantos 0,1 menit; 15 ngantos 17% B ring 0,1 ngantos 0,5 menit; B ring 17 ngantos 55% ring 0,5 ngantos 14 menit; B ring 55 ngantos 70% ring 14 ngantos 14,5 menit; ring 14,5 ngantos 70 ngantos 100% B ring 18 menit; 100% B ring galah 18 ngantos 19 menit; 100 ngantos 0% B ring 19 ngantos 19,1 menit; 0% B ring 19,1 ngantos 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF mamargi ring mode ionisasi positif antuk rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 ngantos 750. Resolusi sane katerapin inggih punika 60.000, lan target ion kontrol gain (AGC) sane kapolihang inggih punika 3×106, lan galah ion maksimum millico1. Sumber ionisasi elektrospray sane kapanas (ESI) mamargi ring tegangan semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udara sarung 60 AU (unit arbitrer), lan aliran udara bantu 20 AU. 250 ̊C. Lensa S punika kagenahang ring 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS asam organik sane madaging label 13C. Endapan metabolit sane masisa (55μl) kaanalisis nganggen sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Termo Fisher Ilmiah) sane kasambungang sareng spektrometer massa QE-HF (Termo Fisher Ilmiah). Cutetnyane, 5μl ekstrak metabolit kasuntikang ring kolom Dionex IonPac AS11-HC sane kalengkapin antuk HPLC (2 mm×250 mm, ukuran partikel 4μm, Thermo Fisher Ilmiah) ring mode loop parsial push-in antuk rasio pengisian 1. 4μm, Ilmiah Nelayan Termo). Suhu kolom kapertahanin ring 30°C, lan autosampler kagenahang ring 6°C. Ngawigunayang kartrid kalium hidroksida sane kasadiaang antuk toya deionisasi anggen ngasilang gradien kalium hidroksida majalaran antuk generator eluen. Pemisahan metabolit antuk kecepatan aliran 380μl/menit, nganggen gradien sekadi ring sor puniki: 0 ngantos 3 menit, KOH 10 mM; 3 ngantos 12 menit, 10 ngantos 50 mM KOH; 12 ngantos 19 menit, 50 ngantos 100 mM KOH; 19 ngantos 21 menit , KOH sane 100 mM; 21 ngantos 21,5 menit, 100 ngantos 10 mM KOH. Kolom punika kaimbangin malih ring sor KOH 10 mM salami 8,5 menit.
Metabolit sane kaelusi kagabungan sareng aliran suplemen isopropanol 150μl/menit sesampun kolom lan salanturnyane kaarah ring spektrometer massa resolusi tinggi sane beroperasi ring mode ionisasi negatif. MS puniki ngawasin kisaran massa saking m/z 50 ngantos 750 antuk resolusi 60.000. AGC kagenahang ring 1×106, lan galah ion maksimum kasimpen ring 100 ms. Sumber ESI sane kapanasang punika kaoperasiang antuk tegangan semprotan 3,5 kV. Setelan sane lianan saking sumber ion inggih punika sakadi ring sor puniki: suhu kapiler 275°C; aliran gas sane wenten ring sarung, 60 AU; aliran gas bantu, 20 AU ring 300°C, lan pengaturan lensa S dados 60 AU.
Panyelehan data saking metabolit sane madaging label 13C. Ngawigunayang piranti lunak TraceFinder (versi 4.2, Termo Fisher Ilmiah) anggen nyelehin data rasio isotop. Identitas soang-soang senyawa kaverifikasi olih senyawa referensi sane andel lan kaanalisis secara independen. Mangda prasida ngamargiang analisis pengayaan isotop, area kromatogram ion sane kaekstraksi (XIC) saking soang-soang isotop 13C (Mn) kaekstraksi saking [M + H] +, ring dija n inggih punika nomor karbon senyawa sasaran, kaanggen antuk nganalisis asam amino utawi [ MH] + kaanggen antuk nganalisis anion. Akurasi massa XIC kirang saking limang bagian per juta, lan akurasi RT inggih punika 0,05 menit. Analisis pengayaan kamargiang antuk ngitung rasio soang-soang isotop sane kadeteksi sareng jumlah makasami isotop senyawa sane anut. Rasio puniki kaicenin pinaka nilai persentase antuk soang-soang isotop, lan pikolihnyane kacihnayang pinaka pengayaan persentase molar (MPE), sakadi sane sampun katlatarang sadurungnyane (42).
Pelet neuron beku kahomogenisasi ring metanol 80% dingin es (v/v), kavorteks, taler kainkubasi ring suhu -20°C salami 30 menit. Vortex malih sampel lan aduk ring suhu +4°C salami 30 menit. Sampel kasentrifugasi ring suhu 21.000 g salami 5 menit ring suhu 4°C, raris supernatan sane kapolihang kapupulang lan kakerisang nganggen konsentrator SpeedVac ring suhu 25°C anggen analisis selanturnyane. Sekadi sane sampun katlatarang ring ajeng, analisis LC-MS kamargiang ring asam amino sel sane kasorohang. Ngawigunayang TraceFinder (versi 4.2, Termo Fisher Ilmiah), analisis data kamargiang ngawigunayang massa monoisotop saking soang-soang senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit kamargiang nganggen paket perangkat lunak praprosesCore (57).
Persiapan irisan. Bikul gelis kaanestesi antuk karbondioksida lan kagetep, otak gelis kaicalang saking tengkorak, lan pisau magetar sane madaging es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) kaanggen ngetepang dados 300 ngantos 375 μm karbon seksi O5d. CO2) Ca2 + ACSF sane rendah (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM, CaCl2 1,0 mM lan Adju 6,0 mM MgCl302. mOSm). Pindahang irisan otak sane kapolihang ka ruangan sane madaging Ca2 + ACSF sane tegehan (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM.pH42l2l MM 4,0 mM) miwah 310 ngantos 320 mOsm). Simpen irisan punika 20 ngantos 30 menit mangda prasida kawaliang sadurung ngarekam.
rekaman. Panggung mikroskop sane kalengkapin antuk ruang rekaman tetep lan lensa objektif immersi toya 20x (Scientifica) kaanggen ring makasami rekaman. Sel Purkinje sane katenger kaidentifikasi antuk (i) ukuran awak, (ii) genah anatomi otak kecil, lan (iii) ekspresi gen reporter mtYFP fluoresen. Pipet tambalan antuk daya tahan ujung 5 ngantos 11 megohm kacabut olih kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Produk Ilmu Pengetahuan, Hofheim, Jerman) lan Instrumen pipet horizontal (P-1000). Makasami rekaman punika kamargiang olih penguat penjepit tambalan npi ELC-03XS (npi elektronik GmbH, Tam, Jerman), sane kakendaliang olih perangkat lunak Sinyal (versi 6.0, Elektronik Cambridge, Cambridge, Inggris). Percobaan punika kacatet antuk kecepatan pengambilan sampel 12,5 kHz. Sinyal punika kasaring antuk kalih filter Bessel short-pass antuk frekuensi cutoff soang-soang 1,3 lan 10 kHz. Kapasitas membran lan pipet punika kaimbangi olih rangkaian kompensasi sane nganggen penguat. Makasami percobaan kamargiang ring sor kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), sané kakendaliang olih perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi miwah analisis rutin ring makasami sel. Pramangkin sadurung ngarekam, isi pipet antuk larutan internal sane madaging zat-zat sekadi ring sor puniki: KCl 4,0 mM, NaCl 2,0 mM, EGTA 0,2 mM, kalium glukonat 135,0 mM, Hepes 10,0 mM (Gufano.TPG5g 4,0 mM) (Na) lan kreatinin fosfat 10,0 mM kasesuaiang antuk pH 7,25, lan tekanan osmotik inggih punika 290 mOsm (sukrosa). Pramangkin sesampun ngamargiang gaya 0 pA mangda prasida mecah membran, potensial membran istirahat kaukur. Resistensi masukan punika kaukur antuk nganggen arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, lan -10 pA. Ngukur gedenyane respons tegangan lan nganggen hukum Ohm anggen ngitung resistansi input. Aktivitas spontan kacatet ring penjepit tegangan salami 5 menit, lan sPSC kaidentifikasi lan kaukur ring Igor Pro (versi 32 7,01, WaveMetrics, Danau Oswego, Oregon, AS) nganggen skrip pengenalan semi otomatis. Kurva IV lan arus steady-state kaukur antuk ngejepit baterai ring potensi sane mabinayan (ngawit saking -110 mV) lan nincapang tegangan ring langkah 5 mV. Produksi AP kauji antuk nganggen arus depolarisasi. Jepit sel ring -70 mV sambilang nerapang pulsa arus depolarisasi. Sesuaiang ukuran langkah soang-soang unit rekaman secara terpisah (10 ngantos 60 pA). Ngitung frekuensi AP maksimum antuk ngitung manual spike pulsa sane ngawinang frekuensi AP sane pinih tegeh. Ambang AP kaselehin antuk nganggen turunan kaping kalih saking pulsa depolarisasi sane kapertama ngawinang siki utawi lebih AP.
Konfigurasi miwah analisis tambalan sane berlubang. Ngamargiang rekaman patch sane berlubang nganggen protokol standar. Anggen pipet bebas ATP- lan GTP sane nenten madaging bahan-bahan sekadi ring sor puniki: glukonat K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM lan MgCl2 2 mM, lan kasesuaiang sareng pH 7,2 (nganggen KOH). ATP miwah GTP kaicalang saking larutan intraseluler mangda nénten permeabilitas membran sel sané nénten prasida kakeniang. Pipet tambalan kadagingin antuk larutan internal sane madaging amfoterisin (kirang langkung 200 ngantos 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) mangda ngamolihang rekaman tambalan sane katebuk. Amfoterisin kalarutang ring dimetil sulfoksida (konsentrasi pamuput: 0,1 ngantos 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO sane kaanggen nenten madue pengaruh sane signifikan ring neuron sane kaselehin. Ring proses punching, resistensi saluran (Ra) terus kapantau, lan percobaan kakawitin sesampun amplitudo Ra lan AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan kaukur ring penjepit tegangan lan/utawi arus salami 2 ngantos 5 menit. Panyelehan data kamargiang nganggen Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, AS), Excel (versi 2010, Perusahaan Microsoft, Redmond, AS) lan GraphPad Prism (versi 8.1.2, Perangkat Lunak GraphPad Inc. Amerika Serikat). Mangda prasida ngidentifikasi AP spontan, plug-in NeuroMatic v3.0c saking IgorPro kaanggen. Otomatis ngidentifikasi AP nganggen ambang batas sane sampun katentuang, sane kasesuaiang soang-soang antuk soang-soang rekaman. Nganggen interval lonjakan, nentuang frekuensi lonjakan antuk frekuensi lonjakan instan maksimum lan frekuensi lonjakan rata-rata.
Isolasi PN. Antuk nganutin protokol sane sampun katerbitang sadurungnyane, PNs kamurniang saking otak bikul ring paletan sane sampun katentuang (58). Cutetnyane, otak kecil kabedah lan kagiling ring media disosiasi dingin es [tanpa HBSS Ca2+ lan Mg2+, kawewehin antuk glukosa 20 mM, penisilin (50 U/ml) lan streptomisin (0,05 mg/ ml)], lan salanturnyane kacerna·media punika antuk mgHC1-1, papal1stein / ml), papain (16 U / ml) lan deoksiribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Karawat salami 30 menit ring suhu 30°C. Kapertama cuci jaringan ring media HBSS sane madaging lendir telur (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) lan DNase (0,1 mg/ml) ring suhu kamar mangda nenten wenten pencernaan enzimatik, lan selanturnyane ring media HBSS sane madaging glukosa 20 mM), Giling alus ring HBmilin5 (0,05 mg/ml) lan DNase (0,1 mg/ml) sane nglepasin sel tunggal. Suspensi sel sane kapolihang kasaring antuk saringan sel 70μm, salanturnyane sel-sel punika kapelet antuk sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) lan kasuspensi malih ring media penyortiran [HBSS, kawewehin antuk glukosa 20 mM, 20% stremilin bovine janin) Serum, (0,05 mg/ml)]; evaluasi viabilitas sel antuk propidium yodida lan nyesuaiang kepadatan sel dados 1×106 ngantos 2×106 sel/ml. Sadurung sitometri aliran, suspensi kasaring antuk saringan sel 50 μm.
Sitometer aliran. Penyortiran sel kamargiang ring suhu 4 °C ngawigunayang mesin FACSAria III (BD Bioilmu) miwah perangkat lunak FACSDiva (BD Bioilmu, versi 8.0.1). Suspensi sel kasorohang nganggen nozzle 100 μm ring sor tekanan 20 psi antuk kecepatan ~2800 peristiwa/detik. Santukan kriteria gerbang tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, miwah karakteristik hamburan) nénten prasida mastikayang isolasi PN sané patut saking soroh sel tiosan, strategi gerbang katetapang manut saking pabandingan langsung intensitas YFP miwah autofluoresensi ring mitoYFP+ ​​miwah kontrol mitoYFP −. YFP kaeksitasi antuk iradiasi sampel antuk garis laser 488 nm, lan sinyal punika kadeteksi nganggen filter band pass 530/30 nm. Ring bikul mitoYFP+, kekuatan relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP taler kawigunayang rikala minayang awak neuron miwah fragmen akson. 7-AAD kaeksitasi antuk laser kuning 561 nm lan kadeteksi antuk filter bandpass 675/20 nm mangda nenten wenten sel-sel sane sampun padem. Mangda prasida masahang astrosit ring galah sane pateh, suspensi sel kawarnai antuk ACSA-2-APC, salanturnyane sampel karadiasi antuk garis laser 640 nm, lan filter bandpass 660/20 nm kaanggen antuk mendeteksi sinyal.
Sel sane kapupulang kapelet antuk sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) lan kasimpen ring suhu -80°C kantos kaanggen. Bikul Mfn2cKO miwah anak alitnyane kaklasifikasiang ring rahina sane pateh mangda prasida ngirangin variabilitas prosedural. Penyajian lan analisis data FACS kamargiang nganggen piranti lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, AS).
Sekadi sane sampun kabaosang ring ajeng (59), PCR real-time kawigunayang anggen ngisolasi DNA saking neuron sane kasorohang anggen kuantifikasi mtDNA selanturnyane. Linieritas miwah sensitivitas ambang batas pangawitnyane kauji antuk ngamargiang qPCR ring makudang sel sane matiosan. Cutetnyane, mupulang 300 PN ring penyangga lisis sane kawangun antuk tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween 20 0,5% lan proteinase K (200 ng/ml) lan kainkubasi ring suhu 55°C 120 menit. Sel-sel punika salanturnyane kainkubasi ring suhu 95°C salami 10 menit mangda prasida mastikayang inaktivasi proteinase K sane jangkep. Ngawigunayang probe TaqMan (Thermo Fisher) sane khusus majeng ring mt-Nd1, mtDNA kaukur antuk PCR semi-kuantitatif ring sistem PCR Fificmosher Real-Time 7900HT (Ther). Sains, nomor katalog Mm04225274_s1), nomor katalog termo gen.
Persiapan sampel proteom. Antuk manasin larutan ring suhu 95 °C salami 10 menit lan sonikasi, ring penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida lan 100 mM tris-HC pelet ring neuron beku]. Ring Bioruptor (Diagenode) salami 10 menit (30 detik denyut nadi/masa jeda 30 detik). Sampel kaencerang 1:10 ring tris-HCl 20 mM (pH 8,0), kacampur sareng 300 ng emas tripsin (Promega), lan kainkubasi semeng ring suhu 37°C mangda prasida ngamolihang pencernaan sane jangkep. Ring rahina kaping kalih, sampel kasentrifugasi ring 20.000 g salami 20 menit. Supernatan kaencerang antuk asam formik 0,1%, lan larutan punika kaencerang antuk StageTips sane kakaryanin ngraga. Sampel punika kakerisang ring instrumen SpeedVac (konsentrasi Eppendorf ditambah 5305) ring suhu 45°C, lan salanturnyane peptida kasuspensi ring asam formik 0,1%. Makasami sampel punika kakaryanin sinarengan olih jadma sane pateh. Anggen nyelehin sampel astrosit, 4 μg peptida asin kadagingin label antuk tag massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110, Thermo Fisher Ilmiah) antuk rasio peptida ring reagen TMT 1:20. Antuk pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT kasuspensi malih ring 70 μl ACN anhidrat, lan peptida kering karekonstitusi dados 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat), sane kawewehin 7 μl reagen TMT ring ACN. Konsentrasi sane wenten inggih punika 43,75%. Sesampune 60 menit inkubasi, reaksi punika kapadem antuk 2 μl hidroksilamin 5%. Peptida sane madaging label kapupulang, kakering, kasuspensi malih ring 200 μl asam formik (FA) 0,1%, kakepah dados kalih, lan salanturnyane ka-desalt nganggen StageTips sane kakaryanin ngraga. Ngawigunayang kromatograf cairan kinerja tinggi ultra UltiMate 3000 (kromatograf cairan kinerja ultra tinggi UltiMate 3000), silih sinunggil saking kalih pahan punika kafraksiang ring kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm sane madaging partikel C18 130Å1,7μm (NoWaters, katalog150). Ilmiah Penangkap Termo). Peptida sane kapisahin antuk kecepatan aliran 30μl/min, kapisahin saking 1% ngantos 50% penyangga B salami 85 menit antuk gradien bertahap 96 menit, saking 50% ngantos 95% penyangga B salami 3 menit, salanturnyane 8 menit antuk 95 % Penyangga B; Penyangga A inggih punika 5% ACN lan 10 mM amonium bikarbonat (ABC), lan penyangga B inggih punika 80% ACN lan 10 mM ABC. Mupulang pecahan nyabran 3 menit lan gabungang dados kalih kelompok (1 + 17, 2 + 18, dll) lan keringin ring sentrifugal vakum.
Panyelehan sane kamargiang antuk LC-MS/MS. Antuk spektrometri massa, peptida (angka r119.aq) kapisahin ring kolom analitis PicoFrit diameter jero 25 cm, 75 μm (lensa objektif anyar, nomor bagian PF7508250) sane kalengkapin antuk 1,9 μm ReproSil-Purse. EASY-nLC 1200 (Ilmiah Nelayan Termo, Jerman). Kolom punika kapertahanin ring suhu 50°C. Penyangga A lan B inggih punika 0,1% asam formik ring toya lan 0,1% asam formik ring 80% ACN, soang-soang. Peptida kapisahin saking 6% ngantos 31% penyangga B salami 65 menit lan saking 31% ngantos 50% penyangga B salami 5 menit antuk gradien 200 nl/menit. Peptida sane kaelusi katitenin ring spektrometer massa fusi Orbitrap (Ilmiah Termo Fisher). Pangukuran m/z prekursor peptida kamargiang antuk resolusi 120.000 ring kisaran 350 ngantos 1500 m/z. Ngawigunayang energi tabrakan sane kanormalisasi 27%, prekursor sane pinih kuat antuk kahanan muatan 2 ngantos 6 kapilih antuk pembelahan dissosiasi jebakan C (HCD) energi sane tegeh. Galah siklus punika kagenahang ring 1 s. Nilai m/z fragmen peptida kaukur ring jebakan ion nganggen target AGC sane pinih alit 5×104 lan galah suntikan maksimum 86 ms. Risampune fragmentasi, prekursor kagenahang ring daftar eksklusi dinamis salami 45 s. Peptida sane madaging label TMT kapasahang ring kolom PepMap Acclam 50 cm, 75 μm (Ilmiah Thermo Fisher, nomor katalog 164942), taler spektrum migrasi kaanalisis ring spektrometer massa Tribrid Orbitrap Lumos (Ilmiah Termo Fisher sane tegeh) (FAIMS) peralatan (Thermo Fisher Scientific) mamargi ring kalih tegangan kompensasi −50 lan −70 V. MS3 sane kapilih madasar antuk prekursor sinkronisasi kaanggen antuk pangukuran sinyal ion laporan TMT. Pemisahan peptida kamargiang ring EASY-nLC 1200, nganggen elusi gradien linier 90%, antuk konsentrasi penyangga 6% ngantos 31%; penyangga A inggih punika 0,1% FA, lan penyangga B inggih punika 0,1% FA lan 80% ACN. Kolom analitis kaoperasiang ring suhu 50°C. Anggen FreeStyle (versi 1.6, Termo Fisher Ilmiah) anggen ngepah file asli manut tegangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi miwah kuantifikasi protein. Ngawigunayang mesin pencari Andromeda sane terpadu, data aslinyane kaselehin nganggen MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Tiosan ring undagan rekombinase Cre miwah YFP sané kapolihang saking Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida karereh antuk undagan kanonik miwah undagan isoform proteom referensi bikul (ID Proteom UP000000589)77, kaunduh saking UniProt ring Mei2. Oksidasi metionin miwah asetilasi N-terminal protein katetapang pinaka modifikasi variabel; metilasi sistein karbamoil katetapang pinaka modifikasi sane tetep. Parameter pencernaan punika kagenahang ring “spesifisitas” lan “tripsin/P”. Peptida lan peptida silet sane kaanggen identifikasi protein sane pinih kidik inggih punika 1; jumlah peptida unik sane pinih kidik inggih punika 0. Ring kondisi pencocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein inggih punika 0,01. Opsi “Peptida Kaping Kalih” sampun kaaktifang. Anggén opsi “cocok pantaraning lari” anggén ngingsirang identifikasi sané sukses pantaraning file asli sané matiosan. Ngawigunayang LFQ rasio minimal wilangan 1 antuk kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ kasaring antuk paling kidik kalih nilai sane valid ring paling kidik asiki kelompok genotipe ring soang-soang titik galah, lan kaekstrapolasi saking distribusi normal antuk linggah. 0,3 lan magingsir ka sor 1,8. Ngawigunayang platform komputasi Perseus lan R (proyek r) anggen nyelehin pikolih LFQ. Tes t moderat kalih arah saking paket perangkat lunak limma kaanggen antuk analisis ekspresi diferensial (61). Panyelehan data eksploratif kamargiang nganggen ggplot, FaktoMineR, faktoekstra, GGally miwah pheatmap. Data proteomik madasar antuk TMT katitenin ngawigunayang MaxQuant versi 1,6,10,43. Ngrereh data proteomik mentah saking basis data proteomik manusa UniProt, sane kaunduh ring bulan September 2018. Analisis punika ngranjing faktor koreksi kemurnian isotop sane sampun kacumawisang olih pabrikan. Anggen limma ring R antuk analisis ekspresi diferensial. Data asli, pikolih panyliksikan basis data, miwah alur kerja analisis data miwah pikolih samian kasimpen ring aliansi ProteomeXchange majalaran antuk repositori mitra PRIDE antuk pengidentifikasi himpunan data PXD019690.
Anotasi fungsional ngawinang sugih analisis. Piranti Analisis Jalur Kecerdasan (QIAGEN) kaanggen nentuang kasugihan istilah anotasi fungsional saking pupulan data ring 8 minggu (Gambar 1). Cutetnyane, daftar protein kuantitatif sane kapolihang saking analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) kaanggen antuk kriteria filter sekadi ring sor puniki: Mus musculus kapilih pinaka spesies lan latar belakang, lan kategori nyihnayang nilai P sane kasesuaiang olih Benjamini antuk pengayaan 0,05 utawi lebih rendah kaanggep signifikan. Antuk grafik puniki, limang kategori kelebihan sane pinih duur ring soang-soang kluster madasar antuk nilai P sane kasesuaiang kasinahang. Ngawigunayang makudang-kudang uji t, ngawigunayang program dorongan linier kalih undagan saking Benjamini, Krieger, lan Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein pamargin galah kamargiang ring kandidat sane mabuat sane kaidentifikasi ring soang-soang kategori, lan soang-soang baris kaanalisis secara terpisah. Nenten perlu ngambil SD sane konsisten.
Mangda prasida nyaihang pikolih tetilikan puniki sareng basis data sane sampun kamedalang lan ngamolihang diagram Venn ring Gambar 1, iraga ngadungang daftar protein kuantitatif sareng anotasi MitoCarta 2.0 (24). Anggen piranti online Gambar Diagram Venn (http) anggen ngasilang diagram punika.
Antuk informasi sane jangkep indik tata cara statistik sane kawigunayang anggen analisis proteomik, durusang wacen ring pahan sane anut ring Materi lan Metode. Antuk makasami eksperimen tiosan, informasi sané jangkep prasida kapanggihin ring legenda sané anut. Sajabaning wenten sane tiosan, samian data kacihnayang pinaka rata-rata ± SEM, lan samian analisis statistik kamargiang nganggen piranti lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Antuk materi paweweh ring artikel puniki, durusang cingakin ring http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/35/6/eaba8271/DC1.
Puniki wantah artikel akses terbuka sane kasobyahang manut ring ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, sane ngicenin kawigunan, distribusi lan reproduksi ring media napi manten, asalkan kawigunan pamuput nenten kaanggen pikolih komersial lan premisnyane inggih punika karya aslinyane patut. Reperensi.
Catetan: Google wantah nunas mangda Sameton ngicénin alamat email mangda jadma sané kaanjurang ring laman punika uning yéning Sameton meled nyingakin email punika lan email punika nénten spam. Google nénten pacang ngambil alamat email napi-napi.
Pitakén puniki kaanggén nguji napiké Sameton dados pengunjung lan nyegah pengiriman spam otomatis.
Olih E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisko, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron sané nénten maguna nyihnayang indik program metabolisme kaaktifang mangda prasida nepasin neurodegenerasi.
Olih E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisko, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik neuron sané nénten maguna nyihnayang indik program metabolisme kaaktifang mangda prasida nepasin neurodegenerasi.
©2020 Asosiasi Amerika antuk Panglimbak Ilmu Pengetahuan. samian hak sampun kacawis. AAAS inggih punika mitra saking HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Lintas miwah PENGHITUNG. Kemajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.