Penyortiran protein ring jalur sekresi mabuat pisan mangda prasida miara kompartementalisasi sel miwah homeostasis. Tiosan ring penyortiran sane kamediasi cangkang, peran lipid ring penyortiran kinesin ring proses transport sekresi inggih punika pitaken dasar sane sampun sue sane durung prasida kacawis. Iriki, iraga ngamargiang pencitraan real-time resolusi tinggi multiwarna simultan 3D anggen muktiang ring vivo inggian protein imobilisasi glikosilfosfatidilinositol sane anyar kasintesis antuk moieties lipid keramida sane dawa pisan kakelompokkan taler kaklasifikasiang dados endoplasma khusus Net usememe sane mabinayan saking situs pemargin protein. Tiosan ring punika, iraga nyihnayang indik panjang rantai seramida ring membran retikulum endoplasma mabuat pisan majeng ring selektifitas penyortiran puniki. Panyelehan iraga ngicénin bukti in vivo langsung kapertama anggén ngeklasifikasiang kargo protein manut saking lantang rantai lipid ring genah ekspor selektif ring jalur sekresi.
Ring sel eukariotik, protein sané kasintesis ring retikulum endoplasma (ER) raris kasorohang selami transportasi saking jalur sekresi mangda prasida kakirim ring genah seluler sané patut (1). Tiosan ring penyortiran sané kamediasi lapisan, sampun sué katarka indik lipid taler prasida dados titik medal selektif antuk ngakelompokkan ring domain membran spesifik sané protein spesifik (2-5). Nanging, kantun kirang bukti in vivo langsung anggen muktiang minab mekanisme madasar antuk lipid puniki. Mangda prasida muputang pikobet dasar puniki, iraga malajahin ring ragi sapunapi protein berlabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) sane kaekspor secara diferensial saking ER. GPI-AP inggih punika makudang-kudang protein permukaan sel sane kasambung sareng lipid ( 6, 7). GPI-AP inggih punika protein sane kasekresi sane neket ring lembaran sisi membran plasma marginin bagian glikolipid (jangkar GPI). Ipun nerima jangkar GPI pinaka modifikasi pasca-translasi konservatif ring lumen ER (8). Sesampune neket, GPI-AP nglintangin aparat Golgi (5, 9) saking ER nuju membran plasma. Kawentenan jangkar GPI ngawinang GPI-AP kaangkut mapasahan saking protein sane kasekresiang transmembran (ngranjing protein membran plasma sane lianan) ring salantang jalur sekresi (5, 9, 10). Ring sel ragi, GPI-AP kapasahang saking protein sané kasekresiang tiosan ring retikulum endoplasma, raris kakemas dados vesikel unik sané kabungkus olih kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Determinan proses klasifikasi puniki ring proses ekspor ER nenten jelas, nanging katarka mekanisme puniki minab ngamerluang lipid, utamanyane remodeling struktural porsi lipid jangkar GPI (5, 8). Ring ragi, remodeling lipid GPI kakawitin langsung sesampun GPI neket, lan ring akeh kasus, punika ngawinang seramida ngiket ring asam lemak jenuh berantai panjang 26 karbon (C26:0) (11, 12). C26 seramida inggih punika seramida utama sane kaproduksi olih sel ragi kantos mangkin. Punika kasintesis ring ER lan akehan sane kaekspor ring aparat Golgi malarapan antuk vesikel COPII (13). Ekspor ER GPI-AP khususnyane ngamerluang sintesis keramida sane sedek kalanturang (14, 15), lan ring gilirannyane, konversi keramida dados inositol fosfat keramida (IPC) ring aparat Golgi gumantung ring sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika antuk membran buatan sampun nyihnayang indik seramida rantai asil sane pinih dawa prasida masikian mangda prasida ngawentuk domain sane maurutan antuk sifat fisik sane unik (17, 18). Data puniki ngawinang hipotesis indik C26 seramida miwah GPI-AP sareng C26 seramida ngawigunayang sifat fisiknyane mangda prasida masikian dados genah utawi genah sane becik ring lingkungan lipid membran ER sane relatif berantakan. Utamanyane kawangun antuk gliserolipid sane cendet lan nenten jenuh (C16:1 lan C18:1) (19, 20). Daerah-daerah puniki pacang selektif fokus ring situs pemargi ER spesifik (ERES), ring dija seramida lan GPI-AP berbasis seramida prasida co-transportasi ke Golgi ring vesikel COPII khusus sane pateh (5).
Ring panyelehan puniki, iraga sampun langsung nguji mekanisme madasar antuk lipid puniki antuk ngawigunayang mikroskop pencitraan real-time konfokal super-resolusi (SCLIM), sane pinaka teknik mikroskop canggih sane prasida sinarengan nitenin protein sane madaging label fluoresensi Sel tiga warna lan tiga dimensi madue resolusi tinggi extreme lan (3D) (21, 22).
Kapertama iraga ngawigunayang teknologi SCLIM anggen nelatarang salanturnyane sapunapi GPI-AP normal antuk kelompok seramida C26 kasaring saking protein sane kasekresiang transmembran risampune matilar saking ER ring S. cerevisiae. Mangda prasida nyelehin klasifikasi ER, iraga nganggen sistem genetik sane prasida langsung memvisualisasikan kargo sane anyar kasintesis sane ngeranjing ring ERES in vivo (7, 23). Pinaka kargo, iraga milih GPI-AP Gas1 madasar keramida C26 sane kadagingin label antuk protein neon hijau (GFP) miwah protein sekresi transmembran Mid2 sane kadagingin label antuk protein neon inframerah nampek (iRFP), makakalih sane kaaptiang membran plasma (24-26). Ring mutan sane sensitif ring suhu sec31-1, kakalih kargo puniki kacihnayang ring sor promotor induksi galaktosa miwah penanda ERES konstitutif. Ring suhu ekstrim (37°C), santukan mutasi sec31-1 ngawinang fungsi komponen lapisan COPII Sec31 anggen ngambatang perkecambahan COPII lan ekspor ER, kargo sane anyar kasintesis mapupul ring ER (23). Risampune dingin kantos suhu sane rendah (24°C), sel mutan sec31-1 mawali becik saking area sekresi, lan kargo sintetis anyar sane mapupul ngawit kaekspor saking ER. Visualisasi CLIM nyihnayang akehnyane Gas1-GFP lan Mid2-iRFP sane anyar kasintesis kantun mapupul ring ER sel mutan sec31-1 sesampun inkubasi ring suhu 37°C lan salanturnyane kalepas ring suhu 24°C salami 5 menit (Gambar 1). Santukan Mid2-iRFP kadistribusiang ring makasami membran ER, lan Gas1-GFP terkonsentrasi lan kapupulang ring area membran ER sane nenten berkelanjutan, distribusinyane pateh pisan (Gambar 1, A ngantos C lan Film S1). Tiosan ring punika, sakadi sane kacihnayang ring Gambar 1D, gugus Gas1-GFP nenten madue Mid2-iRFP. Asil puniki nyihnayang GPI-AP miwah protein transmembran kapasahang dados genah membran ER sané matiosan ring pangawit. Gugus Gas1-GFP nampek sareng ERES spesifik sane kadagingin label antuk protein lapisan COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E lan F, lan film S1) (23).
Sel sec31-1 ngamedalang sekresi sane kainduksi galaktosa, keramida rantai asil panjang (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) lan protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) lan pelabelan ERES Konstruktif puniki Sec13-mCherry ring menit, kagingsirang ka 24°C, lan kacitrayang olih SCLIM 5 menit salanturnyane. (A kantos C) nyinahang gambar 2D sane masikian utawi tunggal sane representatif saking widang (A), gambar proyeksi 2D saking 10 bagian-z (B) utawi gambar belahan sel 3D saking kargo lan penanda ERES (C). Palang skala 1μm (A miwah B). Satuan skala inggih punika 0,551μm (C). Gas1-GFP kadeteksi ring wewidangan utawi kluster ER diskrit, nanging Mid2-iRFP kadeteksi lan kadistribusiang ring makasami membran ER (C). (D) Grafik nyihnayang intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP lan Mid2-iRFP ring gugus Gas1-GFP ring salantang garis panah putih (kiwa). AU, unit sane sewenang-wenang. (E lan F) ngangganin gambar 3D sane ngadungang barang lan tanda ERES. Gugus Gas1-GFP kadeteksi nampek ring ERES spesifik. Satuan skala inggih punika 0,551μm. (F) Panah padat putih nyihnayang gugus Gas1-GFP sane mapaiketan sareng ERES. Panel tengah lan tengen nyihnayang gambar 3D sane kaagengang sane kagabung lan tampilan sane mapiteh saking gugus Gas1-GFP sane kapilih.
Paiketan spasial sane raket pantaraning kluster Gas1-GFP lan ERES spesifik nyihnayang Gas1-GFP prasida ngranjing ring ERES selektif, sane mabinayan sareng selektifitas sane kaanggen olih Mid2-iRFP anggen ninggalin ER. Mangda prasida nanganin kemungkinan punika, iraga ngukur rasio ERES wantah antuk asiki utawi kalih barang (Gambar 2, A ngantos C). Iraga manggihin yening akehan ERES (70%) madaging wantah asiki soroh kargo. Gambar ring sor Gambar 2C nyihnayang kalih conto khas ERES sane wantah nganggen Gas1-GFP (Gambar 1) utawi wantah Mid2-iRFP (Gambar 2). Matungkalikan sareng, kirang langkung 20% ​​saking ERES madaging kalih kargo sane tumpang tindih ring wewidangan sane pateh. Kacingak wenten ERES (10%) madaging kalih soroh kargo, nanging ipun kaisolasi ring wewidangan sane jelas mabinayan. Punika mawinan, analisis statistik puniki nyihnayang yening sesampun ER kaekspor, GPI-AP Gas1-GFP lan kargo transmembran Mid2-iRFP kakepah dados ERES sane matiosan (Gambar 2D). Efisiensi penyortiran puniki banget konsisten sareng analisis biokimia sadurungnyane (6) lan penentuan morfologis (7). Iraga taler prasida nitenin parilaksana kargo sane kakarantina ngeranjing ring ERES (Gambar 2E lan Film S2). Gambar 2E nyihnayang wantah akidik Gas1-GFP (panel 3) utawi Mid2-iRFP (panel 4) sane ngranjing ring ERES saking siki sisi lan kawatesin ring area sane diskrit. Panel 5 saking Gambar 2E nyihnayang Gas1-GFP lan Mid2-iRFP kadang-kadang kapanggihin ring ERES sane pateh, nanging ipun ngranjing saking sisi sane matiosan lan makonsentrasi ring genah sane mabinayan sane minab ngawakilin vesikel COPII sane matiosan. Iraga taler ngukuhang indik pemisahan lan klasifikasi sane katitenin saking GPI-AP Gas1 berbasis seramida C26 pinaka ERES selektif spesifik santukan kargo sekresi transmembran sane lianan, protein membran plasma sane katandain GFP Axl2 (27 ), nyihnayang parilaksana sane pateh sareng Mid2-iRFP. (Gambar S1 miwah Film S3). Axl2-GFP sané anyar kasintesis kadistribusiang saking membran ER sekadi Mid2-iRFP (Gambar S1, A miwah B), miwah kalokalisasi sareng Mid2-iRFP ring katahan ERES (Gambar S1, B ngantos D). Panel 1 lan 2 saking Gambar 1. S1C nyihnayang kalih conto khas ERES ring dija kalih kargo transmembran tumpang tindih. Ring kasus-kasus punika, makakalih barang punika ngranjing ring ERES sareng-sareng (Gambar S1E, Panel 3 lan Film S3).
Sel sec31-1 sane ngekspresiang sekresi induksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) lan Mid2-iRFP (TMP, biru) lan pelabelan ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) kagenahang ring suhu 37 Sesampune kaencebang sekresi ring suhu 30 menit. blok, lan gambar antuk SCLIM sesampun 20 menit. (A kantos C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; bilah skala, 1 μm) utawi gambar belahan bumi sel 3D (B lan C; satuan skala, 0,456 μm) saking kargo lan 10 kepahan z sane katandain olih ERES. Panel sor ring (B) lan panel ring (C) nyinahang gambar sane kaproses mangda wantah nyinahang barang sane wenten ring ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) lan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah terbuka : ERES wantah makta kargo asiki (1 ngantos 4). Panah abu-abu: ERES madaging kargo sane kapisah (5). Panah padat putih: ERES sane madaging kargo sane magenah sareng-sareng. Ring sor puniki: ERES tunggal sane kapilih wantah madaging Gas1-GFP (1) utawi Mid2-iRFP (2). Palang skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf sane sampun katlatarang ring (C). Rata-rata persentase ERES sane madaging wantah asiki kargo (Gas1-GFP utawi Mid2-iRFP), kargo sane kapisah lan kargo sane tumpang tindih. Ring tiga percobaan independen, n=432 ring 54 sel. Bilah kaiwangan = SD. Tes t sane nenten mapasangan kalih buntut. *** P = 0,0002. (E) Gambar 3D ERES sane kapilih saking kargo sane kakarantina sane kacihnayang antuk (C). Gas1-GFP (hijau) (3) utawi Mid2-iRFP (biru) (4) ngranjing ring ERES (magenta) saking siki sisi lan kawatesin ring area sane alit ring jeroning ERES. Kadang-kadang, makakalih soroh kargo punika ngranjing ring ERES sane pateh (5) saking sisi sane pateh lan kawatesin ring genah sane terisolasi ring jeroning ERES. Palang skala, 100 nm.
Selanturnyane, iraga nguji hipotesis indik keramida rantai asil panjang (C26) sane wenten ring membran ER nyokong kluster spesifik lan penyortiran Gas1 dados ERES selektif. Antuk punika, iraga nganggen galur ragi sane kauwah GhLag1, ring dija kalih sintesis seramida endogen Lag1 lan Lac1 kagentosin antuk GhLag1 (homolog Lag1 kapas), ngasilang galur ragi antuk galur membran sel Ceramide sane cendet saking tipe liar (Gambar 3A) (2). Analisis spektrometri massa (MS) nyihnayang ring strain tipe liar, 95% saking total seramida punika seramida rantai sane pinih panjang (C26), nanging ring GhLag1, 85% saking seramida punika pinih panjang (C18 lan C16). ), wantah 2% saking seramida sane rantainyane dawa pisan (C26) seramida. Yadiastun keramida C18 lan C16 inggih punika keramida utama sane kadeteksi ring membran GhLag1 kantos mangkin, analisis MS taler nyantenang indik jangkar GPI Gas1-GFP sane kaekspresiang ring galur GhLag1 madaging keramida C26, sane setara sareng lipid tipe liar. Kualitasnyane pateh (Gambar 3A) (26). Punika mawinan, puniki maartos enzim remodeling seramida Cwh43 selektif pisan majeng ring seramida C26, sakadi sane kacihnayang ring Gambar 26, punika pinih seneng ngeranjingang jangkar GPI saking akidik seramida C26 ring strain GhLag1. S2 (29). Yadiastun asapunika, membran sel GhLag1 dasarnyane wantah madaging seramida C18-C16, nanging Gas1-GFP kantun madue seramida C26. Kasujatian puniki ngawinang galur puniki dados piranti sane becik anggen khusus muputang pikobet panjang rantai asil membran seramida ring ER. Peran hipotetis kelas miwah penyortiran. Raris, kapertama iraga malajahin kemampuan C26 Gas1-GFP sane mapupul ring kluster ring GhLag1 antuk alel mutan sensitif suhu sec31-1 malarapan antuk mikroskop fluoresensi konvensional, ring dija wantah rantai panjang (C18-C16) sane wenten ring membran ER Ceramide (Gambar 3). Iraga nitenin yening ring sec31-1, akehan Gas1-GFP terkonsentrasi ring kluster, nanging Gas1-GFP ring sec31-1 GhLag1 antuk membran ER keramida panjang (C18-C16) panjang utamanyane nenten kakelompokkan lan terdistribusi ring Ring makasami membran ER. Mangda tepat, santukan klustering berbasis seramida C26 mapaiketan sareng ERES spesifik (Gambar 1), selanturnyane iraga nyelehin napike proses puniki minab taler nyarengin fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP nganggen sistem COPII khusus anggen ekspor ER, sane aktif kaatur olih remodeling struktural Ted1′s ring bagian glikan jangkar GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan raris kauningin olih kompleks reseptor kargo transmembran p24, sané raris selektif ngerekrut Lst1, sané pinaka isoform spesifik saking subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, ngwentuk Vesikel COPII sané sugih GPI-AP-33 kaperluang (33). Punika mawinan, iraga ngwangun mutan ganda sane ngabungin penghapusan protein tunggal puniki (komponen kompleks p24 Emp24, enzim remodeling GPI-glikan Ted1 lan subunit COPII spesifik Lst1) antuk strain mutan sec31-1, lan malajahin ipun Napike prasida ngawentuk Gasster GFP1-clu3). Iraga nitenin yening ring sec31-1emp24Δ lan sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP utamanyane nenten berkelompok lan terdistribusi ring sejebag membran ER, sakadi sadurungnyane kacingak ring sec31-1 GhLag1, nanging ring sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Sekadi sec3. Pikolih puniki nyihnayang tiosan ring kawentenan seramida C26 ring membran ER, klustering Gas1-GFP taler perlu ngiket ring kompleks p24, lan nenten ngamerluang rekrutmen Lst1 sane spesifik. Raris, iraga nyelehin minab lantang rantai seramida ring membran ER prasida ngatur paiketan Gas1-GFP ring p24. Nanging, iraga manggihin kawentenan seramida C18-C16 ring membran nenten ngawinang GPI-glikan sane karekonstruksi olih kompleks p24 (Gambar S3 lan S4, A lan B) utawi ngiket GPI-AP lan ngekspor GPI-AP. kamampuan. Rekrut subtipe COPII Lst1 (Gambar S4C). Punika mawinan, kluster sané gumantung ring seramida C26 nénten ngamerluang interaksi protein sareng mekanisme protein ekspor ER sané matiosan, sakéwanten nyokong mekanisme penyortiran alternatif sané kasokong olih lantang lipid. Raris, iraga nganalisis napike panjang rantai asil seramida ring membran ER mabuat pisan anggen klasifikasi efektif Gas1-GFP pinaka ERES selektif. Saantukan Gas1 ring galur GhLag1 antuk seramida berantai pendek matilar saking ER lan ngranjing ring membran plasma (Gambar S5), iraga percaya yening penyortiran punika kasokong olih panjang rantai asil seramida, Gas1 ring galur GhLag1 prasida kaalih lan kaliwatin. Barang ERES sane madue membran sane pateh.
(A) Membran sel GhLag1 utamanyane madaging seramida C18-C16 sane cendet, nanging jangkar GPI Gas1-GFP kantun madue IPC C26 sane pateh sareng sel tipe liar. Ring baduur: analisis panjang rantai asil seramida ring membran sel tipe liar (Wt) lan strain GhLag1p antuk spektrometri massa (MS). Data punika nyihnayang persentase saking makasami keramida. Rata-rata saking tiga percobaan independen. Bilah kaiwangan = SD. Tes t sane nenten mapasangan kalih buntut. **** P <0,0001. Panel sor: Analisis MS panjang rantai asil IPC sane wenten ring jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) sane kaekspresiang ring strain tipe liar lan GhLag1p. Data punika ngangganin persentase sinyal IPC sane jangkep. Rata-rata saking limang percobaan independen. Bilah kaiwangan = SD. Tes t sane nenten mapasangan kalih buntut. ns, nenten penting. P = 0,9134. (B) Mikrograf fluoresensi sel sek31-1, sek31-1 GhLag1, sek31-1emp24Δ, sek31-1ted1Δ lan sek31-1lst1Δ sel sane ngekspresiang Gas1-GFP sane kainduksi galaktosa kainkubasi ring suhu 37°C lan rutin lan 37 °C salami. sesampun 24°C. Panah putih: Gugus ER Gas1-GFP. Panah terbuka: Gas1-GFP sane nenten berkelompok kadistribusiang ring makasami membran ER, nyihnayang pewarnaan cincin inti karakteristik ER. Palang skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf sane sampun katlatarang ring (B). Persentase rata-rata sel antuk struktur Gas1-GFP sane bertitik. Ring tiga percobaan independen, n≥300 sel. Bilah kaiwangan = SD. Tes t sane nenten mapasangan kalih buntut. **** P <0,0001.
Mangda prasida langsung muputang pikobet puniki, iraga ngamargiang visualisasi SCLIM Gas1-GFP lan Mid2-iRFP ring GhLag1 antuk alel mutan sec31-1 sane sensitif ring suhu (Gambar 4 lan Film S4). Risampune ER kagenahang ring suhu 37°C lan salanturnyane kalepas ring suhu 24°C, akehan Gas1-GFP sane anyar kasintesis nenten kakelompokkan lan kadistribusiang ring makasami membran ER, sekadi sane katitenin olih mikroskop konvensional (Gambar 4, A lan B ). Tiosan ring punika, persentase sane ageng saking ERES (67%) ngranjing kalih soroh kargo sane magenah sareng-sareng ring tengahnyane (Gambar 4D). Panel 1 miwah 2 saking Gambar 4C nyihnayang kalih imba khas ERES antuk tumpang tindih Gas1-GFP miwah Mid2-GFP. Tiosan ring punika, makakalih barang punika karekrut dados ERES sane pateh (Gambar 4E, panel 3 lan film S4). Punika mawinan, pikolih iraga nyihnayang panjang rantai asil seramida ring membran ER inggih punika penentu sane mabuat ring agregasi lan klasifikasi protein ER.
Sec31-1 Sel GhLag1 sane nyihnayang sekresi sane kainduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) lan Mid2-iRFP (TMP, biru) lan Sec13-mCherry sane madaging label ERES konstitutif (ERES, magenta) Inkubasi ring suhu 37 °C. Lanturang 30 menit, tedunang kantos 24°C mangda prasida ngelepasin sekresi, lan gambar antuk SCLIM sesampun 20 menit. (A kantos C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; bilah skala, 1 μm) utawi gambar belahan bumi sel 3D (B lan C; satuan skala, 0,45 μm) saking 10 kepahan z sane katandain olih kargo lan ERES. Panel sor ring (B) lan panel ring (C) nyinahang gambar sane kaproses mangda wantah nyinahang barang sane wenten ring ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) lan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah sane madaging putih : ERES, barang tumpang tindih. Bukak panah: ERES wantah madaging asiki barang. Panel sor: ERES sane kapilih madue barang tumpang tindih (1 lan 2) sane kacihnayang ring (C). Palang skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf sane sampun katlatarang ring (C). Ring unit sec31-1 lan sec31-1 GhLag1, wantah asiki kargo (Gas1-GFP utawi Mid2-iRFP) sane ngranjing, lan persentase rata-rata ERES antuk kargo terisolasi lan kargo tumpang tindih. Ring tiga percobaan independen, n = 432 ring 54 sel (detik31-1) lan n = 430 ring 47 sel (detik31-1 GhLag1). Bilah kaiwangan = SD. Tes t sane nenten mapasangan kalih buntut. *** P = 0,0002 (detik31-1) miwah ** P = 0,0031 (detik31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D ERES sane kapilih antuk kargo tumpang tindih (3) sane kacihnayang ring (C). Gas1-GFP (hijau) lan Mid2-iRFP (biru) nampekin ERES (magenta) saking sisi sane pateh lan tetep ring area sane kawatesin ERES sane pateh. Palang skala, 100 nm.
Panyelehan puniki ngicénin bukti langsung in vivo indik kargo protein madasar lipid kaklasifikasiang dados genah ekspor selektif ring jalur sekresi, miwah nyihnayang mabuat pisan lantang rantai asil ring selektifitas klasifikasi. Ngawigunayang teknik mikroskop sane kuat lan canggih sane kawastanin SCLIM, iraga nyihnayang Gas1-GFP sane anyar kasintesis (membran plasma utama GPI-AP antuk porsi lipid seramida rantai asil (C26) sane pinih dawa) ring ragi ) Wewidangan sane kakelompokkan ring protein transmbrame diskrit sane terdistribusi marginin ERES, membran ER sane wenten (Gambar 1). Lianan ring punika, kalih soroh barang puniki ngranjing ring ERES sane matiosan secara selektif (Gambar 2). Lantang rantai asil seramida seluler ring membran katedunang saking C26 dados C18-C16, gugus Gas1-GFP kagentosin ring wewidangan ER diskrit, lan Gas1-GFP kagentosin rute mangda matilar saking ER antuk protein transmembran nglintangin ERES sane pateh (Gambar 3 lan Gambar 3). 4).
Yadiastun GPI-AP ngawigunayang mekanisme protein khusus mangda prasida medal saking ER, iraga manggihin indik pemisahan C26 sane gumantung ring seramida nenten ngandelang interaksi protein diferensial sane prasida ngawinang spesialisasi ERES (Gambar S4 lan S5). Tiosan punika, pikolih iraga nukung mekanisme klasifikasi alternatif sané kasokong olih kluster protein madasar antuk lipid miwah salanturnyané nénten malih kargo tiosan. Panyelehan iraga nyihnayang indik wewidangan utawi gugus Gas1-GFP sane mapaiketan sareng ERES spesifik kirang protein sane kasekresiang transmembran Mid2-iRFP, sane nyihnayang indik gugus GPI-AP sane gumantung ring seramida C26 pacang ngawentenang fasilitas ngeranjingnyane ring ERES sane relevan, lan ring galah sane pateh, ngecualian sekretasi transmembran tertentu puniki (Gambar ES1). 2). Semalihne, kawentenan seramida C18-C16 ring membran ER nenten ngawinang GPI-AP ngawentuk daerah utawi kluster, dadosnyane nenten ngecualiang utawi ngentosin protein sane kasekresiang transmembran dados ERES sane pateh (Gambar 3 lan 4). . Punika mawinan, iraga ngusulang mangda C26 ceramide nyokong pemisahan miwah klasifikasi antuk ngawentenang fasilitas pengelompokan protein sane mapaiketan sareng ERES spesifik.
Sapunapi carane mangda prasida ngamolihang kluster sane gumantung ring seramida C26 puniki dados area ER sane sampun katentuang? Kacenderungan membran seramida mapasahan ring sisi prasida ngawinang GPI-AP miwah C26 seramida ngwentuk lipid sané alit miwah langsung maurutan ring genah lipid sané nénten becik saking membran ER sané madaging gliserolipid sané cendet miwah nénten jenuh. Kelompok sane madue kualitas (17, 18). Gugus sementara sane alit puniki prasida salanturnyane masikian dados gugus sane agengan lan stabil sesampun ngiket ring kompleks p24 (34). Konsisten sareng puniki, iraga nyihnayang C26 Gas1-GFP perlu berinteraksi sareng kompleks p24 mangda prasida ngawentuk gugus sane kacingak sane agengan (Gambar 3). Kompleks p24 inggih punika oligomer heterozigot sané kawangun antuk petang protein transmembran p24 sané matiosan ring ragi (35), sané ngicénin paiketan multivalen, sané prasida ngawinang paiketan silang saking gugus GPI-AP alit, raris ngasilang gugus Stabil sané agengan (34). Interaksi pantaraning ektodomain protein GPI-AP taler prasida nagingin ring agregasi ipun, sekadi sané kacihnayang selami transportasi Golgi ring sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Nanging, rikala C18-C16 seramida wenten ring membran ER, rikala kompleks p24 ngiket sareng Gas1-GFP, gugus sane ageng sane mabinayan nenten pacang kawentuk. Mekanisme sane dados dasar minab manut ring sifat fisik miwah kimia ceramida rantai asil sane dawa. Studi biofisika membran buatan nyihnayang yadiastun keramida rantai asil sane dawa (C24) lan cendet (C18-C16) prasida ngawinang pemisahan fase, wantah seramida rantai asil sane dawa (C24) sane prasida ngalimbakang Curvature sane tegeh lan bending film anggen ngewangun malih film. Malarapan antuk saling rujukan (17, 37, 38). Sampun mabukti heliks transmembran TMED2, homolog manusa Emp24, selektif berinteraksi sareng sfingomielin berbasis keramida C18 ring lobus sitoplasma (39). Ngawigunayang simulasi dinamika molekuler (MD), iraga manggihin indik seramida C18 lan C26 mapupul ring sajeroning lobus sitoplasma heliks transmembran Emp24, lan ipun madue preferensi sane pateh (Gambar S6). Patut kauratiang indike puniki nyihnayang heliks transmembran Emp24 prasida ngawinang distribusi asimetris lipid ring membran. Puniki pinaka asil sane anyar madasar antuk sel mamalia. Simulasi MD sane pateh taler nyihnayang kawentenan lipid eter (40) . Punika mawinan, iraga maspekulasi yening C26 seramida ring kalih lobus ER26 punika kasugihan lokal. Rikala GPI-AP ring lobus luminal langsung ngiket p24 multivalen lan akumulasi seramida C26 ring sekitar p24 ring lobus sitoplasma, punika prasida ngalimbakang agregasi Protein sane nyarengin lan lengkungan membran sane kapolihang saking jerijin tangan (41), ngawinang GPI-AP taler mapasahan dados daerah adsen sane tegeh wewidangan ring membran ER (42). Laporan sadurungnyane sampun ngadukung mekanisme sane kaunggahang (43, 44). Ikatan multivalen oligolektin, patogen utawi antibodi majeng ring glikosfingolipid berbasis keramida (GSL) ring membran plasma ngawinang agregasi GSL sane ageng, nincapang pemisahan fase lan ngawinang deformasi lan internalisasi membran (44). Iwabuchi dll (43) Kacingak yening ring kawentenan rantai asil sane dawa (C24) nanging nenten cendet (C16), ligan multivalen sane kaiket sareng laktosilseramida GSL ngawinang kawentuknyane gugus sane ageng lan invaginasi membran, lan transduksi sinyal sitoplasma sane kamediasi Lyn olih neutral ring selebaran chagitropil inggih punika interduksi.
Ring sel epitel terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) ring tingkat membran plasma apikal ngontrol pemisahan lan penyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi puniki kasokong olih oligomerisasi GPI-AP (36), nanging minab taler gumantung ring panjang rantai seramida sane kapanggihin iraga ring ragi. Yadiastun GPI-AP mamalia madue jangkar sane madasar antuk lipid eter, lan struktur kimianyane mabinayan pisan sareng seramida rantai asil sane pinih dawa, ring penelitian sane anyar manggihin indik makakalih lipid madue sifat fisik lan kimia sane pateh manut evolusi Lan fungsi (40). Punika mawinan, pahan lipid eter ring sel mamalia minab mesib sareng seramida C26 ring ragi, lan perannyane inggih punika mapaiketan sareng seramida berantai panjang ring membran anggen ngalimbakang agregasi lan penyortiran GPI-AP. Yadiastun minab puniki kantun patut kauji langsung, pikolih sadurungnyane nukung inggian transportasi seramida rantai asil sane dawa nuju awak Golgi nenten kamargiang olih protein transfer sitoplasma, nanging manut ring sintesis jangkar GPI sekadi ragi. Punika mawinan, mekanisme konservatif evolusioner kacingak prasida selektif sareng-sareng ngangkut seramida rantai asil sane pinih dawa lan GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ring vesikel pengangkutan sane pateh.
Ring sistem sel epitel terpolarisasi ragi miwah mamalia, agregasi GPI-AP miwah pemisahan saking protein membran plasma tiosan makasami mamargi sadurung rauh ring baduur sel. Paladino miwah sane lianan. (48) manggihin ring TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, kluster GPI-AP nenten ja wantah kabuatang ring klasifikasi selektif GPI-AP ring membran plasma apikal, nanging taler ngatur organisasi kluster GPI-AP lan aktivitas biologisnyane. Permukaan sel. Ring ragi, tetilikan puniki nyihnayang indik kluster GPI-AP sane gumantung ring seramida C26 ring ER prasida ngatur organisasi kluster lan aktivitas fungsional GPI-AP ring membran plasma (24, 49). Konsisten sareng model puniki, sel GhLag1 alergi ring inhibitor GPI utawi tamba sane ngawinang integritas dinding sel (28), lan kabuatang kluster Gas1-GFP fungsional (49) saking ceramide ujung sane kaproyeksiang ring kawinan sel ragi nyihnayang G Minab konsekuensi fisiologis sel hLag1. Kaiwangan GPI-AP. Nanging, nguji salanturnyane napike organisasi fungsional permukaan sel sampun kaprogram saking ER antuk metode penyortiran madasar antuk panjang lipid pacang dados subjek penelitian iraga benjang pungkur.
Strain Saccharomyces cerevisiae sane kaanggen ring karya puniki kasurat ring Tabel S1. Strain MMY1583 miwah MMY1635 saking SCLIM anggen pencitraan sel idup kawangun antuk latar belakang W303. Strain puniki sane ngekspresiang Sec13-mCherry antuk tag protein fluoresen kawangun nganggen metode madasar antuk reaksi berantai polimerase (PCR) antuk plasmid pFA6a pinaka cetakan (23). Strain sane ngekspresiang Mid2-iRFP sane kadagingin label antuk protein fluoresen sane katitenin olih promotor GAL1 kawangun sekadi ring sor puniki. Amplifikasi PCR saking undagan iRFP-KanMx saking vektor pKTiRFP-KAN (hadiah saking E. O'Shea, nomor plasmid Addgene 64687; pengidentifikasi sumber daya penelitian (RRID): Addgene_64687 Risampune paletan genom Mid2-iRFP kakuatin taler kakloning ring promotor GAL1, punika kagapukang ring genah Not I-Sac I saking plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 sane kapolihang kalinier sareng Pst I mangda prasida terintegrasi ring lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP kacihnayang ring sor kontrol promotor GAL1 ring plasmid centromer (CEN), sane kawangun sekadi ring sor puniki. Undagan Gas1-GFP kakuatin antuk PCR saking plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah L. Popolo) taler kakloning ring genah Xma I-Xho I saking plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah C) . Tukang; Plasmid sane kawewehin sane akehnyane 51225; 51225; RRID: Paweweh_51225). Plasmid sane kapolihang kawastanin pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP taler kaekspresiang ring sor kontrol promotor GAL1 saking vektor pBEVY-GL LEU2, taler wangunannyane sekadi ring sor puniki. Undagan Axl2-GFP kakuatin saking plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) antuk PCR, taler kakloning ring genah Bam HI-Pst I saking vektor LEU2 pBEVY-GL. Plasmid sane kapolihang kawastanin pRGS12. Runtutan oligonukleotida sane kaanggen ring tetilikan puniki kasurat ring Tabel S2.
Strain punika kawewehin antuk 0,2% adenin lan 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] ekstrak ragi sugih protein p (YP) media (1 % ekstrak ragi lan 2% protein ept). (YPR)] utawi 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] pinaka sumber karbon, utawi ring media minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi lan 0,5% amonium sulfat) anggen nyangkepin asam amino lan basa sane patut sane kabuatang ring nutrisi , Lan madaging 2% media galaktosa minimal2 ( (media minimal galaktosa sintetis) pinaka sumber karbon.
Antuk pencitraan galah nyata, sel mutan sec31-1 sane peka ring suhu sane nyihnayang konstruksi ring sor promotor GAL1 katumbuhin ring media YPR ring suhu 24 °C semeng kantos fase tengah log. Sesampune induksi ring YPG ring suhu 24°C salami 1 jam, sel-sel punika kainkubasi ring SG ring suhu 37°C salami 30 menit, lan salanturnyane kagingsirang ring 24°C mangda kalepas saking blok sekresi. Concanavalin A kawigunayang anggen mecikang sel ring slide kaca lan kacitrayang olih SCLIM. SCLIM inggih punika kombinasi saking mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 lan sistem lensa minyak bukaan numerik UPlanSApo 100 × 1,4 (Olympus), pemindai spektrometer konfokal cakram berputar kecepatan tinggi lan rasio sinyal-ke-suara tinggi (Yokogawa Electric, lan khusus), (Fotonik Hamamatsu) prasida ngicenin sistem lensa pembesar antuk pembesaran pamuput ×266,7 lan kamera perangkat sane mapaiketan sareng muatan sane ngalihang elektron (Fotonik Hamamatsu) (21). Akuisisi gambar kamargiang antuk piranti lunak khusus (Yokogawa Listrik). Antuk gambar 3D, iraga nganggen aktuator piezoelektrik sane kakaryanin khusus anggen ngegetar lensa objektif secara vertikal, lan mupulang bagian optik sane mabinayan 100 nm ring tumpukan. Gambar tumpukan Z kauwah dados data voxel 3D, miwah fungsi penyebaran titik teoritis sane kaanggen ring mikroskop konfokal cakram sane maputa kaanggen ring pemrosesan dekonvolusi olih perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Antuk ngawigunayang piranti lunak Volocity mangda otomatis ngamargiang wates antuk analisis ko-lokasi, ERES rumasuk kargo kaukur. Analisis pindai garis kamargiang nganggen perangkat lunak MetaMorph (Perangkat Molekuler).
Anggen piranti lunak GraphPad Prism anggen nentuang signifikansi statistik. Antuk tes t Sisia kalih ekor lan tes analisis varians satu arah biasa (ANOVA), pabinayan pantaraning kelompok kaanggep madue iusan sane signifikan majeng ring P <0,05 (*).
Antuk mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log katumbuhin semeng ring YPD taler kapupulang antuk sentrifugasi, kacuci ping kalih antuk saline penyangga fosfat, taler kainkubasi ring es kirang langkung 15 menit, taler kalanturang ring sor mikroskop sekadi sane sampun katlatarang sadurungnyane (Check24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 minyak PH3 CS) sane kalengkapin antuk lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu lan perangkat lunak Suite Aplikasi X (LAS X) kaanggen ring akuisisi. .
Sampel kadenaturasi antuk penyangga sampel SDS ring suhu 65 °C salami 10 menit, lan salanturnyane kapisahin antuk elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Antuk analisis imunoblotting, 10 μl sampel kamuat nyabran jalur. Antibodi primer: Ngawigunayang anti-Gas1 poliklonal kelinci antuk pangenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci antuk pangenceran 1:500, miwah anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah saking H. Riezman) antuk pangenceran 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal bikul kawigunayang antuk pangenceran 1:5000 (hadiah saking J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Lobak peroksidase (HRP) konjugasi kambing anti kelinci imunoglobulin G (IgG) sane kaanggen ring pengenceran 1:3000 (Pierce). IgG anti bikul kambing sane kakonjugasi HRP kaanggen ring pengenceran 1:3000 (Pierce). Zona respons imun katitenin antuk metode kemiluminesen reagen Pico Barat SuperSignal (Thermo Fisher Ilmiah).
Sekadi sane katlatarang ring (31), percobaan imunopresipitasi alami kamargiang ring fraksi ER sane kapiara. Cutetnyane, cuci sel ragi antuk penyangga TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, campuran fenilmetilsulfonil fluorida 1 mM lan campuran penghambat protease) ring 600 nm ( OD600 kalih kali) ring 100 optik. Punika kapegat antuk manik-manik kaca, lan salanturnyane leluu sel lan manik-manik kaca kaicalang antuk sentrifugasi. Supernatan raris kasentrifugasi ring 17.000 g salami 15 menit ring suhu 4°C. Pelet kasuspensi malih ring TNE lan saponin digitalis kawewehin kantos konsentrasi pamuput 1%. Suspensi kainkubasi salami 1 jam antuk rotasi ring suhu 4°C, raris komponen sane nenten larut kaicalang antuk sentrifugasi ring suhu 13.000 g ring suhu 4°C salami 60 menit. Antuk imunopresipitasi Gas1-GFP, kapertama pra-inkubasi sampel antuk manik-manik agarose kosong (ChromoTek) ring suhu 4°C salami 1 jam, raris kainkubasi antuk GFP-Trap_A (ChromoTek) ring suhu 4°C salami 3 jam. Manik-manik imunopresipitasi kacuci ping lima antuk TNE sane madaging digoksigenin 0,2%, kaelusi antuk penyangga sampel SDS, kapisahin ring SDS-PAGE, lan kaanalisis antuk imunoblotting.
Sekadi sane sampun katlatarang ring (31), penentuan cross-linking kamargiang ring fraksi ER sane kapiara. Gelisan carita, fraksi ER sane kapiara kainkubasi antuk ditiobis (suksinimidil propionat) 0,5 mM (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, AS; 20 °C, 20 menit). Reaksi pengikat silang kapadem antuk ngawewehin glisin (konsentrasi pamuput 50 mM, 5 menit, 20°C).
Sekadi sane sampun katlatarang sadurungnyane (50), analisis MS seramida ring strain tipe liar lan GhLag1 kamargiang. Cutetnyane, sel-sel punika katumbuhin kantos fase eksponensial (3 ngantos 4 unit OD600/ml) ring YPD ring suhu 30°C, lan 25×107 sel sane kapanen. Metabolisme ipun kapadem antuk asam triklorasetat. Ngawigunayang pelarut ekstraksi [etanol, toya, eter, piridin lan amonium hidroksida 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] lan 1,2 nmol kualitas seramida C17 standar internal (860517, lipid kutub Avanti). Ngawigunayang reagen monometilamin [metanol, toya, n-butanol lan larutan metilamin (4:3:1:5 v/v)] anggen ngamargiang hidrolisis alkali ringan saking ekstrak, lan salanturnyane nganggen n-butanol sane jenuh toya anggen ngilangang asin. Pamuputnyane, ekstrak punika kasuspensi malih ring pelarut mode positif [kloroform/metanol/toya (2:7:1) + amonium asetat 5 mM] lan kasuntikang ring spektrometer massa. Monitoring multi-reaksi (MRM) kamargiang anggen identifikasi miwah kuantifikasi molekul sfingolipid. Spektrometer massa quadrupole tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) kasarengin antuk sumber ion aliran nano robot Nanomate HD (Biosains Advion, Ithaca, NY) anggen nitenin lipid. Energi tabrakan punika kaoptimalkan antuk soang-soang kategori keramida. Data MS kapolihang antuk mode positif. Antuk soang-soang ulangan biologis, sinyal lipid inggih punika median saking tiga pangukuran independen.
Sekadi sane sampun katlatarang ring (31), sel (800×107) sane ngekspresiang Gas1-GFP keni imunopresipitasi alami. Gas1-GFP sane sampun kamurniang kapasahang antuk SDS-PAGE lan kagingsirang ring membran poliviniliden fluorida (PVDF). Protein punika kacihnayang antuk ngewarnain PVDF antuk amida ireng. Pita Gas1-GFP katebas saking PVDF lan kacuci 5 kali antuk metanol lan apisan antuk toya kelas kromatografi cair-MS (LC-MS). Antuk ngawentenang inkubasi strip membran antuk 500 μl NaOAc 0,3 M (pH 4,0), penyangga lan 500 μl campuran natrium nitrit 1 M sane anyar kalarutang ring suhu 37°C salami 3 jam, fraksi lipid kalepas saking Gas1-GFP lan inosa inosamin sane kalisis Pelepasan cerkosamin (51). Sesampune punika, strip membran kacuci petang kalih antuk toya kelas LC-MS, kering ring suhu kamar, lan kasimpen ring atmosfer nitrogen ring suhu -80°C kantos kaanalisis. Pinaka kontrol, sampel kosong membran PVDF kaanggen ring soang-soang percobaan. Lipid sane kaekstraksi saking Gas1-GFP raris kaanalisis olih MS sekadi sane sampun katlatarang (50). Cutetnyane, strip PVDF sane madaging GPI-lipid kasuspensi malih ring pelarut cetakan negatif 75μl [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] lan nglintangin ionisasi elektrosemprot (ESI)-Analisis MRM/MS spesies sfingolipid (TSQ Vantage). Ring parindikan puniki, data MS kapolihang ring mode ion negatif.
Sakadi sane sampun kabaosang ring ajeng, porsi lipid jangkar GPI kapasahang saking GPI-AP sane madaging label [3H]-inositol (16). Lipid kapisahin antuk kromatografi lapisan tipis nganggen sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) lan kacihnayang nganggen FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel sane ngekspresiang Gas1-GFP (600×107) kacuci ping kalih antuk penyangga TNE antuk penyangga TNE, lan kapecah antuk manik-manik kaca, lan salanturnyane kasentrifugasi anggen ngicalang leluu sel lan manik-manik kaca. Supernatan raris kasentrifugasi ring 17.000 g salami 1 jam ring suhu 4°C. Pelet kacuci ring TNE lan kainkubasi antuk 1 U PI-PLC (Invitrogen) ring TNE sane madaging saponin digitalis 0,2% salami 1 jam ring suhu 37°C. Sesampune perlakuan enzim, membran punika kaicalang antuk sentrifugasi ring suhu 17.000 g ring suhu 4°C salami 1 jam. Anggen ngamargiang imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan kainkubasi antuk GFP-Trap_A (ChromoTek) ring suhu 4 °C semeng. Gas1-GFP sane kamurniang sane kapisahin olih SDS-PAGE kawarnai antuk warna biru cemerlang Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP kagetep saking warna abu-abu sane ngiterin akuaduk, lan salanturnyane risampune alkilasi antuk iodoasetamida lan reduksi antuk ditiotreitol, pencernaan ring gel antuk tripsin kamargiang. Ekstrak lan kering peptida tryptik lan peptida antuk GPI-glikan. Peptida sane sampun kering kalarutang ring toya 20 μl. Suntikan porsi (8μl) ring LC. Kolom oktadesilsilan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter tengah 150 mm×1,0 mm; Kimia Nomura, Prefektur Aichi, Jepang) kawigunayang anggen masahang peptida ring kahanan gradien sane sampun katentuang. Fase mobile inggih punika pelarut A (0,08% asam formik) lan pelarut B (0,15% asam formik ring 80% asetonitril). Sistem HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) kawigunayang anggen ngelusi kolom antuk pelarut A salami 55 menit antuk kecepatan aliran 50 μl min-1 salami 5 menit, raris konsentrasi pelarut B katincapang dados 40%. , Amerika Serikat). Eluat terus kagenahang ring sumber ion ESI, lan peptida triptik lan peptida antuk GPI-glikan kaanalisis olih LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa jebakan ion linier hibrida-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Ring setup MS, tegangan sumber kapiler kagenahang ring 4,5 kV, lan suhu kapiler transfer kagenahang ring 300°C. Tegangan kapiler lan tegangan lensa tabung soang-soang kagenahang ring 15 V lan 50 V. Data MS kapolihang ring mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagian per juta) ring kisaran massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS gumantung ring jebakan ion ring XLthe dibit, pertama di LTQ Ors3. disosiasi sane kacihnayang olih tabrakan (CID)].
Simulasi MD kamargiang nganggen piranti lunak GROMACS (52) lan medan gaya MARTINI 2 (53-55). Pembangun Membran GUI CHARMM (56, 57) raris kaanggen ngwangun lapisan ganda sane madaging dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) lan Cer C18 utawi DOPC lan Cer C26. Topologi miwah koordinat Cer C26 mawit saking DXCE antuk ngicalang manik-manik ekstra saking ikuh sfingosin. Anggen proses sane katlatarang ring sor puniki anggen ngimbangin lapisan ganda lan ngejalanin, salanturnyane anggen koordinat pamuput sistem anggen ngwangun sistem sane madaging Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 kantos 193) kawangun pinaka heliks-α ngawigunayang struktur molekul alat visual MD (VMD) (58). Raris, risampune ngicalang lipid sane matumpuk, protein punika ka granulasi kasar lan kagenahang ring lapisan ganda nganggen CHARMM GUI. Sistem sane kaping untat madaging 1202 DOPC lan 302 Cer C26 utawi 1197 DOPC lan 295 Cer C18 lan Emp24. Ngion sistem kantos konsentrasi 0,150M. Petang ulangan independen kakaryanin antuk kalih komposisi lapisan ganda.
Lapisan ganda lipid kaimbangin nganggen proses CHARMM GUI, sane nyarengin minimalisasi lan salanturnyane ngimbangin 405.000 langkah, ring dija kendala posisi saka kidik kaicalang lan kaicalang, lan langkah galah katincapang saking 0,005 ps dados 0,02 ps. Sesampune seimbang, ngasilang 6 μs antuk langkah galah 0,02 ps. Sesampune ngeranjingang Emp24, nganggen proses GUI CHARMM sane pateh anggen ngirangin lan ngimbangin sistem, lan salanturnyane mamargi salami 8 s ring produksi.
Antuk samian sistem, rikala proses penyeimbangan, tekanan punika kakendaliang olih barostat Berendsen (59), lan rikala proses produksi, tekanan punika kakendaliang olih barostat Parrinello-Rahman (60). Ring samian kasus, tekanan rata-rata inggih punika 1 bar lan skema kopling tekanan semi-isotropik sane kaanggen. Ring proses keseimbangan lan produksi, termostat (61) antuk rekalibrasi kecepatan kaanggen ngapasang suhu partikel protein, lipid lan pelarut soang-soang. Ring sajeroning makasami operasi, suhu sane kaaptiang inggih punika 310K. Interaksi non-ikatan kaitung antuk ngamedalang daftar pasangan nganggen skema Verlet antuk toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb kaitung nganggen medan reaksi lan jarak cut-off 1,1 nm. Istilah Vander Waals ngawigunayang skema cut-off antuk jarak cut-off 1,1 nm, miwah skema cut-off Verlet kawigunayang antuk potensi penyimpangan (62).
Ngawigunayang VMD, panjang gelombang cutoff pantaraning manik-manik fosfat DOPC utawi manik-manik seramida AM1 lan protein inggih punika 0,7 nm, lan akeh lipid sane berinteraksi sareng protein kaitung. Manut rumus ring sor puniki, itung faktor depletion-pengayaan (DE) sakadi ring (63): Faktor DE = (jumlah total lipid ring protein 0,7) ring protein 0,7 (jumlah Cer ring total lipid) .
Nilai sane kalaporang kapolihang pinaka rata-rata, lan bilah kaiwangan inggih punika petang salinan independen saking SE. Signifikansi statistik faktor DE kaitung antuk uji t [(rata-rata faktorDE-1)/SE]. Ngitung nilai P saking distribusi sane asiki buntut.
Piranti GROMACS kaanggen ngitung peta kepadatan lateral 2D sistem sane madaging Emp24 ring 250 ns pamuput jejak. Mangda prasida ngamolihang peta pengayaan/depletion seramida, peta kepadatan Cer kakepah antuk jumlah peta Cer lan DOPC, lan salanturnyane kakepah antuk konsentrasi Cer ring angga. Skala peta warna sane pateh kaanggen.
Antuk materi paweweh ring artikel puniki, durusang cingakin ring http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/6/50/eaba8237/DC1.
Puniki wantah artikel akses terbuka sane kasobyahang manut ring ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, sane ngicenin kawigunan, distribusi lan reproduksi ring media napi manten, asalkan kawigunan pamuput nenten kaanggen pikolih komersial lan premisnyane inggih punika karya aslinyane patut. Reperensi.
Catetan: Google wantah nunas mangda Sameton ngicénin alamat email mangda jadma sané kaanjurang ring laman punika uning yéning Sameton meled nyingakin email punika lan email punika nénten spam. Google nénten pacang ngambil alamat email napi-napi.
Pitakén puniki kaanggén nguji napiké Sameton dados pengunjung lan nyegah pengiriman spam otomatis.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi tinggi 3D nyihnayang mabuat pisan lantang rantai seramida anggen nyorohang protein ring genah output selektif.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi tinggi 3D nyihnayang mabuat pisan lantang rantai seramida anggen nyorohang protein ring genah output selektif.
©2020 Asosiasi Amerika antuk Panglimbak Ilmu Pengetahuan. samian hak sampun kacawis. AAAS inggih punika mitra saking HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Lintas miwah PENGHITUNG. Kemajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.