Metabolit imunomodulator inggih punika fitur utama saking lingkungan mikro tumor (TME), sakéwanten antuk makudang-kudang sajabaning, identitasnyané katahan nénten kauningin. Iriki, iraga nganalisis tumor lan sel T saking tumor lan asma pasien karsinoma serous kelas tinggi (HGSC) anggen ngungkapang metabolom kompartemen TME sane mabinayan puniki. Ascites miwah sel tumor madué pabinayan metabolit sané jimbar. Yening saihang sareng asma, sel T sane infiltrasi tumor punika signifikan sugih antuk 1-metilnikotinamida (MNA). Yadiastun kawéntenan MNA ring sel T nincap, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim sané ngamargiang katalisis transfer gugus metil saking S-adenosilmetionin ka nikotinamida) wantah ring fibroblas miwah sel tumor. Sekadi fungsi, MNA ngawinang sel T mangda ngamedalang faktor nekrosis tumor sitokin sané ngawinang tumor alfa. Punika mawinan, MNA sane mawit saking TME prasida ngawantu ring regulasi kekebalan sel T taler ngangganin target imunoterapi sane becik anggen nambanin kanker manusa.
Metabolit sane mawit saking tumor prasida madue efek inhibitor sane dalem ring imunitas anti-tumor, lan sayan akeh bukti sane nyihnayang indik ipun taler prasida dados pendorong kunci ring perkembangan penyakit (1). Tiosan ring efek Warburg, pakaryan sane anyar sampun ngawit nyihnayang kahanan metabolisme sel tumor lan paiketannyane sareng kahanan imun lingkungan mikro tumor (TME). Penelitian ring model bikul miwah sel T manusa sampun nyihnayang indik metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) miwah metabolisme glukosa (4) prasida mamargi independen ring makudang-kudang subkelompok sel imun. Makudang-kudang metabolit ring jalur puniki ngambat fungsi anti-tumor sel T. Sampun mabukti yening blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) prasida ngrusak proliferasi sel T, lan nincapnyane BH4 ring angga prasida nincapang respons imun anti tumor sane kamediasi olih CD4 lan CD8. Lianan ring punika, efek imunosupresif kynurenine prasida kaselamatang antuk ngajeng BH4 (5). Ring glioblastoma mutan isositrat dehidrogenase (IDH), sekresi enantiometabolik (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) ngambat aktivasi sel T, proliferasi lan Aktivitas sitolisis (6). Wawu-wawu puniki, sampun mabukti indik metilglioksal, produk sampingan glikolisis, kakaryanin olih sel supresor sane mawit saking mieloid, lan transfer sel T metilglioksal prasida ngambat fungsi sel T efektor. Ring perawatan, netralisasi metilglioksal prasida ngaonang aktivitas sel supresor sane mawit saking myeloid (MDSC) lan sinergis nincapang terapi blokade pos pemeriksaan ring model bikul (7). Panyelehan puniki sareng-sareng ngutamayang peran kunci metabolit sané mawit saking TME ring ngatur fungsi miwah aktivitas sel T.
Disfungsi sel T sampun akeh kalaporang ring kanker ovarium (8). Puniki atenganyane sangkaning karakteristik metabolisme sane melekat ring hipoksia lan vaskular tumor abnormal (9), sane ngasilang konversi glukosa lan triptofan dados produk sampingan sekadi asam laktat lan kynurenin. Laktat ekstraseluler sané kalintang prasida ngirangin produksi interferon-γ (IFN-γ) miwah nyokong diferensiasi subkelompok mielosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan langsung ngambat proliferasi sel T lan ngambat sinyal reseptor sel T (12-14). Tiosan saking panyelehan puniki, akeh pakaryan ngenenin indik metabolisme imun sane kamargiang ring kultur sel T in vitro ngawigunayang media sane pinih becik, utawi kawatesin antuk model bikul homolog in vivo, nenten wenten sane nyihnayang heterogenitas kanker manusa miwah wawidangan makro miwah mikro fisiologis.
Ciri umum kanker ovarium inggih punika penyebaran peritoneum lan metunyane asma. Akumulasi cairan sel ring asma mapaiketan sareng penyakit sane sampun lanjut lan prognosis sane kaon (15). Manut laporan, kompartemen sane unik puniki hipoksik, madue kadar faktor pertumbuhan endotel pembuluh darah (VEGF) lan indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO) sane tegeh, lan kainfiltrasi olih sel pengatur T lan sel penghambat mieloid (15-18). Lingkungan metabolisme ascites minab mabinayan sareng tumor punika, dadosnyane pemrograman ulang sel T ring ruang peritoneum nenten jelas. Tiosan ring punika, pabinayan utama lan heterogenitas pantaraning ascites lan metabolit sane wenten ring lingkungan tumor prasida ngawinang infiltrasi sel imun lan fungsinyane ring tumor, lan kabuatang penelitian salanturnyane.
Mangda prasida muputang pikobet puniki, iraga ngrancang metode pemisahan sel sensitif lan spektrometri massa tandem kromatografi cair (LC-MS/MS) anggen malajahin jenis sel sane mabinayan (ngranjing sel CD4 + lan CD8 + T) taler ring jero lan pantaraning tumor Metabolitnyane ngelintangin sel ring asma sane pateh lan lingkungan pasien tumor. Iraga ngawigunayang metode puniki sinarengan sareng sitometri aliran dimensi tinggi miwah sekuensing RNA sel tunggal (scRNA-seq) anggen ngicenin gambaran sane pinih becik indik status metabolisme populasi kunci puniki. Metode puniki nyihnayang panincapan sane signifikan ring kadar 1-metilnikotinamida (MNA) ring sel T tumor, lan percobaan in vitro nyihnayang efek imunomodulator MNA ring fungsi sel T sadurungnyane nenten kauningin. Sekadi umum, pidabdab puniki nyihnayang paiketan metabolisme pantaraning tumor miwah sel imun, taler ngicenin wawasan sane unik indik metabolit regulasi imun, sane minab mawiguna anggen nambanin imunoterapi kanker ovarium madasar antuk sel T Peluang pengobatan.
Iraga nganggen sitometri aliran dimensi tinggi antuk sinarengan ngukur pengambilan glukosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukosa (2-NBDG) lan aktivitas mitokondria [MitoTracker Merah Dalem, DR01) penanda khas sane minayang sel imun lan populasi sel tumor (Tabel S2 lan Gambar S1A). Analisis puniki nyihnayang yening saihang sareng sel T, ascites lan sel tumor madue tingkat pengambilan glukosa sane tegehan, nanging madue pabinayan sane alitan ring aktivitas mitokondria. Rata-rata pengambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] inggih punika tiga ngantos petang kali lipat saking sel T, lan rata-rata pengambilan glukosa sel CD4 + T inggih punika 1,2 kali lipat saking sel CD8 + T, sane nyihnayang limfosit infiltrasi tumor ring metabolisme TME (TIL) sane mabinayan sane kabuatang saGambar e). Semaliha, aktivitas mitokondria ring sel tumor mesib sareng sel CD4 + T, lan aktivitas mitokondria ring kalih jenis sel punika tegehan ring sel CD8 + T (Gambar 1B). Sekadi umum, pikolih puniki nyihnayang tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor tegehan ring sel CD4 + T, lan aktivitas metabolisme sel CD4 + T tegehan ring sel CD8 + T. Yadiastun efek puniki ring makudang-kudang jenis sel, nenten wenten pabinayan sane konsisten ring status metabolisme sel CD4 + lan CD8 + T utawi proporsi relatifnyane ring asma yening saihang sareng tumor (Gambar 1C). Semalihne, ring fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM+ ring tumor nincap yening saihang sareng asma (Gambar 1D). Iraga taler nyingakin pabinayan metabolisme sane jelas pantaraning komponen sel EpCAM+ lan EpCAM-. Sel EpCAM+ (tumor) madue pengambilan glukosa lan aktivitas mitokondria sane tegehan saking sel EpCAM-, sane joh tegehan saking aktivitas metabolisme fibroblas ring sel tumor ring TME (Gambar 1, E lan F).
(A lan B) Intensitas fluoresensi median (LKM) pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) lan aktivitas mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker barak gelap) (B) Grafik perwakilan (kiwa) lan data tabulasi (Kanan), sel CD8 + T lan sel tumor EpCAM + CD45-. (C) Rasio sel CD4 + lan CD8 + (saking sel CD3 + T) ring asma lan tumor. (D) Kawéntenan sel tumor EpCAM + ring asma miwah tumor (CD45−). (E lan F) EpCAM + CD45-tumor lan EpCAM-CD45-matriks pengambilan glukosa (2-NBDG) (E) lan aktivitas mitokondria (MitoTracker barak gelap) (F) grafik perwakilan (kiwa) lan data tabulasi ( Tengen) Asma lan sel tumor. (G) Grafik perwakilan ekspresi CD25, CD137 lan PD1 antuk sitometri aliran. (H lan I) Ekspresi CD25, CD137 lan PD1 ring sel CD4 + T (H) lan sel CD8 + T (I). (J lan K) Fenotipe naif, memori pusat (Tcm), efektor (Teff) lan memori efektor (Tem) madasar antuk ekspresi CCR7 lan CD45RO. Gambar representatif (kiwa) lan data tabular (kanan) sel CD4 + T (J) lan sel CD8 + T (K) ring asma lan tumor. Nilai P sane katentuang antuk uji t mapasangan (*P<0,05, **P<0,01 lan ***P<0,001). Garis punika ngangganin pasien sane cocok (n = 6). FMO, fluoresensi minus siki; LKM, intensitas fluoresensi median.
Panyelehan salanturnyane nyihnayang pabinayan sane signifikan tiosan pantaraning status fenotipik sel T sane pinih kapuputang. Memori sane kaaktifang (Gambar 1, G ngantos I) lan efektor (Gambar 1, J lan K) ring tumor joh lebih sering tekening asma (proporsi sel CD3 + T). Asapunika taler, nganalisis fenotipe antuk ekspresi penanda aktivasi (CD25 lan CD137) lan penanda depletion [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] nyihnayang yadiastun karakteristik metabolisme populasi puniki mabinayan (Gambar S1, B ngantos E) , Nanging nenten wenten pabinayan metabolisme sane signifikan subservise utawi konsisten (Gambar S1). F ngantos I). Pikolih puniki kacumpuin antuk nganggen metode pembelajaran mesin antuk otomatis netepang fenotipe sel (21), sane salanturnyane ngungkapang kawentenan sel sumsum tulang sane akeh (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ring asma pasien (Gambar S2A ). Pantaraning samian soroh sel sane sampun kaidentifikasi, populasi sel myeloid puniki nyihnayang pengambilan glukosa lan aktivitas mitokondria sane pinih tegeh (Gambar S2, B ngantos G). Pikolih puniki nyihnayang pabinayan metabolisme sane kuat pantaraning makudang-kudang jenis sel sane kapanggihin ring ascites lan tumor ring pasien HGSC.
Tantangan utama ring sajeroning ngresepang karakteristik metabonomik TIL inggih punika kabuatang ngisolasi sampel sel T sane murni, kualitas lan kuantitasnyane cukup saking tumor. Studi sane anyar sampun nyihnayang indik metode penyortiran lan pengayaan manik madasar antuk sitometri aliran prasida ngawinang pauwahan profil metabolit seluler (22-24). Mangda prasida nanganin pikobet puniki, iraga ngoptimalkan metode pengayaan manik-manik anggen ngisolasi lan ngisolasi TIL saking kanker ovarium manusa sane kareseksi secara bedah sadurung kaanalisis olih LC-MS/MS (cingak Bahan lan Metode; Gambar 2A). Mangda prasida ngajiang ius makasami saking protokol puniki ring pauwahan metabolit, iraga nyandingang profil metabolit sel T sane kaaktifang olih donor sane sehat sesampun langkah pemisahan manik ring ajeng sareng sel sane nenten manik kapisahin nanging tetep ring es. Analisis kontrol kualitas puniki manggihin wenten korelasi sane tegeh pantaraning kalih kahanan puniki (r = 0,77), lan teknis pengulangan kelompok 86 metabolit madue pengulangan sane tegeh (Gambar 2B). Punika mawinan, metode puniki prasida ngamargiang analisis metabolit sane akurat ring sel sane ngamargiang pengayaan jenis sel, mawinan ngicenin platform resolusi tinggi kapertama anggen ngidentifikasi metabolit spesifik ring HGSC, mawinan prasida ngawinang jadma ngamolihang pangresep sane sayan teleb indik spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Diagram skematik pengayaan manik magnet. Sadurung kaanalisis antuk LC-MS/MS, sel-sel punika pacang ngamargiang tigang babak pengayaan manik magnetik berturut-turut utawi tetep ring es. (B) Panglalah saking soroh pengayaan ring akehnyane metabolit. Rata-rata tiga pangukuran antuk soang-soang soroh pengayaan ± SE. Garis abu-abu nyihnayang paiketan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) saking pangukuran maulang-ulang kasinahang ring label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematis alur kerja analisis metabolit pasien. Ascites utawi tumor punika kapupulang saking pasien lan kasimpen ring krio. Atenga alit saking soang-soang sampel kaanalisis antuk aliran sitometri, nanging sampel sane masisa ngamargiang tigang babak pengayaan antuk sel CD4+, CD8+ lan CD45-. Fraksi sel puniki kaanalisis nganggen LC-MS/MS. (D) Peta panas saking kekayaan metabolit sane sampun standar. Dendrogram nyihnayang pangrumpukan Ward saking jarak Euclidean pantaraning sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) peta metabolit sampel, nyihnayang tiga replika saking soang-soang sampel, sampel saking pasien sane pateh kasambungang antuk garis. (F) PCA profil metabolit sampel sane kakondisiang ring pasien (inggih punika, nganggen redundansi parsial); jenis sampel sane kawatesin olih lambung cembung. PC1, sane dados komponen utama 1; PC2, pahan utama 2.
Selanturnyane, iraga nganggen metode pengayaan puniki anggen nganalisis 99 metabolit ring fraksi sel CD4 +, CD8 + lan CD45 ring asma lan tumor primer saking nem pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A lan Tabel S3 lan S4). Populasi sane kakayunin inggih punika 2% kantos 70% saking sampel ageng asli sel idup, taler proporsi sel banget mabinayan pantaraning pasien. Risampune masahang manik-manik, fraksi sane kapiara sane kaperluang (CD4+, CD8+ utawi CD45-) ngawetuang langkungan saking 85% saking makasami sel sane maurip ring sampel rata-rata. Metode pengayaan puniki ngawinang iraga prasida nganalisis populasi sel saking metabolisme jaringan tumor manusa, sane nenten prasida kamargiang saking sampel sane ageng. Ngawigunayang protokol puniki, iraga nentuang l-kinurenin lan adenosin, kalih metabolit imunosupresif sane madue ciri becik puniki katincapang ring sel T tumor utawi sel tumor (Gambar S3, B lan C). Punika mawinan, pikolih puniki nyihnayang kasatyan lan kemampuan pemisahan sel iraga lan teknologi spektrometri massa anggen ngarereh metabolit sane mabuat secara biologis ring jaringan pasien.
Analisis iraga taler ngungkapang pemisahan metabolisme sane kuat saking jenis sel ring jero lan pantaraning pasien (Gambar 2D lan Gambar S4A). Secara khusus, yening saihang sareng pasien sane lianan, pasien 70 nyihnayang karakteristik metabolisme sane mabinayan (Gambar 2E lan Gambar S4B), nyihnayang minab wenten heterogenitas metabolisme sane substansial pantaraning pasien. Patut kauratiang yening saihang sareng pasien sane lianan (1,2 ngantos 2 liter; Tabel S1), jumlah total asma sane kapupulang ring pasien 70 (80 ml) alitan. Kontrol heterogenitas antar pasien salami analisis komponen utama (contonyane, nganggen analisis redundansi parsial) nyihnayang pauwahan sane konsisten pantaraning soroh sel, lan soroh sel lan/utawi lingkungan mikro sane jelas kaagregasi manut profil metabolit (Gambar 2F ). Panyelehan metabolit tunggal ngutamayang panglalah puniki miwah nyihnayang pabinayan sané signifikan pantaraning soroh sel miwah lingkungan mikro. Patut kauratiang yening pabinayan sane pinih ekstrim sane katitenin inggih punika MNA, sane biasane kasugihan ring sel CD45- lan ring sel CD4+ lan CD8+ sane infiltrasi ring tumor (Gambar 3A). Antuk sel CD4 +, efek puniki pinih jelas, lan MNA ring sel CD8 + taler kacingak banget keni pengaruh lingkungan. Nanging, indike puniki nenten mabuat, santukan wantah tiga saking nem pasien sane prasida kaevaluasi antuk skor CD8+ tumor. Lianan ring MNA, ring soroh sel sane mabinayan ring ascites lan tumor, metabolit sane lianan sane kaon kacihnayang ring TIL taler sugih diferensial (Gambar S3 lan S4). Punika mawinan, data puniki nyihnayang makudang-kudang metabolit imunomodulator sane majanji anggen penelitian salanturnyane.
(A) Kandungan MNA sane kanormalisasi ring sel CD4+, CD8+ lan CD45- saking asma lan tumor. Plot kotak nyihnayang median (garis), rentang antarkuartil (engsel bingkai) lan rentang data, ngantos 1,5 kali rentang antarkuartil (kumis bingkai). Sekadi sane sampun katlatarang ring Materi lan Metode Pasien, nganggen nilai limma pasien anggen nentuang nilai P (*P<0,05 lan **P<0,01). (B) Gambar skematik indik metabolisme MNA (60). Metabolit sane wenten ring ajeng: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein sane wenten ring; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida sane kaanggen; 2-PY, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamida sane kaanggen; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida sane kaanggen; NR, ribosa sane nikotinamida; NMN, mononukleotida nikotinamida. Enzim (hijau): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sane ngawinang; NAMPT, inggih punika nikotinamida fosforibosil sane katransfer; AOX1, aldehida oksidase sane 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase sane wenten ring; NMNAT, nikotinamida mono nukleotida adenilat transferase sane sampun kasurat; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE saking scRNA-seq asma (abu-abu) lan tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT ring populasi sel sane mabinayan sane kaidentifikasi nganggen scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT lan AOX1 ring SK-OV-3, ginjal embrio manusa (HEK) 293T, sel T lan sel T sane karawat antuk MNA. Ekspresi sane kalipet kasinahang relatif majeng ring SK-OV-3. Pola ekspresi antuk SEM kacihnayang (n = 6 donor sane seger). Nilai Ct sane agengan saking 35 kabaos nenten prasida kadeteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 lan SLC22A2 ring SK-OV-3, HEK293T, sel T lan sel T sane karawat antuk MNA 8mM. Ekspresi sane kalipet kasinahang relatif majeng ring SK-OV-3. Pola ekspresi antuk SEM kacihnayang (n = 6 donor sane seger). Nilai Ct sane agengan saking 35 kabaos nenten prasida kadeteksi (UD). (G) Kandungan MNA sel ring sel T donor sehat sane kaaktifang sesampun 72 jam inkubasi sareng MNA. Pola ekspresi antuk SEM kacihnayang (n = 4 donor sane seger).
MNA kakaryanin antuk ngingsirang gugus metil saking S-adenosil-1-metionin (SAM) nuju nikotinamida (NA) olih nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT kaekspresiang berlebihan ring makudang-kudang kanker manusa lan mapaiketan sareng proliferasi, invasi lan metastasis (25-27). Mangda prasida becik ngresepang sumber MNA ring sel T ring TME, iraga nganggen scRNA-seq anggen ngaciriang ekspresi NNMT lintas jenis sel ring ascites lan tumor tiga pasien HGSC (Tabel S5). Analisis kirang langkung 6.500 sel nyihnayang ring lingkungan ascites lan tumor, ekspresi NNMT kawatesin ring populasi fibroblas lan sel tumor sane kaduga (Gambar 3, C lan D). Patut kauratiang yening nenten wenten ekspresi NNMT sane jelas ring populasi napi kemanten sane ngekspresiang PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D lan Gambar S5A), sane nyihnayang MNA sane kadeteksi ring spektrum metabolit sampun kagenahang ring sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) ngubah MNA dados 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) utawi 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4- PYR); Gambar 3B) taler kawatesin ring populasi fibroblas sane ngekspresiang COL1A1 (Gambar S5A), sane sinarengan nyihnayang sel T kirang madue kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen sane mapaiketan sareng MNA puniki kaverifikasi nganggen set data sel independen kaping kalih saking asma saking pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Tiosan ring punika, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor sehat sane karawat antuk MNA nyihnayang yening saihang sareng sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT utawi AOX1 meh-mehan nenten kaekspresiang (Gambar 3E). Asil sane nenten kajangka puniki nyihnayang MNA prasida kasekresi saking fibroblas utawi tumor ring sel T sane nampek ring TME.
Yadiastun kandidat rumasuk kulawarga pengangkut kation organik 1 ngantos 3 (OCT1, OCT2 lan OCT3) sane kakode olih kulawarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 lan SLC22A3), pengangkut potensial MNA kantun nenten katentuang (28) . QPCR mRNA saking sel T donor sane sehat nyihnayang tingkat ekspresi SLC22A1 sane rendah nanging tingkat SLC22A2 sane nenten prasida kadeteksi, sane ngukuhang indik punika sampun kalaporang sadurungnyane ring literatur (Gambar 3F) (29). Semalihne, garis sel tumor ovarium SK-OV-3 nyihnayang tingkat sane tegeh saking kalih transporter (Gambar 3F).
Mangda prasida nguji minab sel T madue kemampuan nyerep MNA asing, sel T donor sane sehat kabudayang salami 72 jam ring kawentenan konsentrasi MNA sane mabinayan. Yening nenten wenten MNA eksogen, kandungan seluler MNA nenten prasida kadeteksi (Gambar 3G). Nanging, sel T sane kaaktifang sane karawat antuk MNA eksogen nyihnayang panincapan kadar MNA sane gumantung ring dosis ring sel, ngantos 6 mM MNA (Gambar 3G). Asil puniki nyihnayang yadiastun tingkat ekspresi transporter sane rendah lan kirangnyane enzim utama sane bertanggung jawab ring metabolisme MNA intraseluler, TIL kantun prasida ngambil MNA.
Spektrum metabolit ring sel T pasien miwah percobaan penyerapan MNA in vitro nincapang minab fibroblas sané mapaiketan sareng kanker (CAF) ngamedalang MNA miwah sel tumor prasida ngatur fenotipe miwah kawigunan TIL. Anggen nentuang panglalah MNA ring sel T, sel T donor sane seger kaaktifang in vitro antuk wenten utawi nenten wenten MNA, taler proliferasi miwah produksi sitokinnyane kaevaluasi. Sesampune 7 rahina ngawewehin MNA ring dosis sane pinih ageng, jumlah penggandaan populasi moderat kirang, nanging vigor tetep ring makasami dosis (Gambar 4A). Tiosan ring punika, perawatan MNA eksogen ngasilang nincapnyane proporsi sel T CD4 + lan CD8 + sane ngekspresiang faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Semaliha, produksi intraseluler IFN-γ sayan ngidikang ring sel CD4 + T, nanging nenten ring sel CD8 + T, lan nenten wenten pauwahan sane signifikan ring interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C lan D). Punika mawinan, assay imunosorben sane kaiket sareng enzim (ELISA) saking supernatan saking kultur sel T sane karawat antuk MNA puniki nyihnayang panincapan sane signifikan ring TNFα, panurunan IFN-γ, lan nenten wenten pauwahan ring IL-2 (Gambar 4, E ngantos G). . Penurunan IFN-γ nyihnayang MNA minab madue peran ring ngambat aktivitas anti-tumor sel T. Mangda prasida ngamargiang simulasi efek MNA ring sitotoksisitas sane kamediasi sel T, sel reseptor antigen kimerik T (FRα-CAR-T) sane kaaptiang reseptor folat α lan CAR-T (GFP) sane kaatur olih sel protein fluoresen hijau (GFP) -CAR-T) kakaryanin olih sel donor perifer getih mononuclear PBMC). Sel CAR-T kapanakang salami 24 jam antuk kawentenan MNA, raris kapanakang sareng sel tumor ovarium SK-OV-3 manusa sane nyihnayang reseptor folat α ring rasio efektor kantos target 10:1. Perawatan MNA ngasilang panurunan sane signifikan ring aktivitas pembunuhan sel FRα-CAR-T, sane mesib sareng sel FRα-CAR-T sane karawat antuk adenosin (Gambar 4H).
(A) Total jumlah sel layak lan penggandaan populasi (PD) langsung saking kultur ring rahina 7. Grafik batang ngawakilin rata-rata + SEM saking nem donor sane sehat. Ngangganin data saking paling kidik n = 3 eksperimen independen. (B ngantos D) CD3/CD28 lan IL-2 kaanggen ngaktifkan sel T ring konsentrasi MNA soang-soang salami 7 rahina. Sadurung kaanalisis, sel-sel kastimulasi antuk PMA/ionomisin antuk GolgiStop salami 4 jam. Ekspresi TNFα (B) ring sel T. Conto gambar (kiwa) miwah data tabular (kanan) ekspresi TNFα ring sel-sel sané maurip. Ekspresi IFN-γ (C) miwah IL-2 (D) ring sel T. Ekspresi sitokin kaukur antuk sitometri aliran. Grafik batang nyihnayang rata-rata (n = 6 donor sane sehat) + SEM. Ngawigunayang analisis varians satu arah lan pangukuran berulang (*P<0,05 lan **P<0,01) anggen nentuang nilai P. Ngangganin data saking paling kidik n = 3 eksperimen independen. (E ngantos G) CD3/CD28 lan IL-2 kaanggen ngaktifkan sel T ring konsentrasi MNA soang-soang salami 7 rahina. Media kapupulang sadurung lan sesampun 4 jam stimulasi PMA/ionomisin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) lan IL-2 (G) sane kaukur antuk ELISA. Grafik batang nyihnayang rata-rata (n = 5 donor sane seger) + SEM. Nilai P katentuang nganggen analisis varians satu arah lan pangukuran maulang (*P<0,05). Garis titik-titik nyihnayang wates deteksi saking deteksi. (H) Assay lisis sel sane kamargiang. Sel FRα-CAR-T utawi GFP-CAR-T kasesuaiang antuk adenosin (250 μM) utawi MNA (10 mM) salami 24 jam, utawi katinggalin nenten karawat (Ctrl). Persentase pembunuhan sel SK-OV-3 sane kaukur. Nilai P sane katentuang antuk uji t Welch (*P<0,5 lan **P<0,01).
Mangda prasida ngamolihang pangresepan mekanistik indik regulasi ekspresi TNFα sane gumantung ring MNA, pauwahan mRNA TNFα sel T sane karawat antuk MNA kaevaluasi (Gambar 5A). Sel T donor sane seger sane katambanin antuk MNA nyihnayang panincapan kalih lipat ring tingkat transkripsi TNFα, nyihnayang MNA gumantung ring regulasi transkripsi TNFα. Anggen nyelehin mekanisme pengaturan sane minab puniki, kalih faktor transkripsi sane kauningin sane ngatur TNFα, inggih punika faktor inti sel T sane kaaktifang (NFAT) lan protein spesifik 1 (Sp1), kaevaluasi pinaka respons majeng ring pengikatan MNA ring promotor TNFα proksimal ( 30). Promotor TNFα madaging 6 genah ngiket NFAT sane sampun kaidentifikasi lan 2 genah ngiket Sp1, tumpang tindih ring siki genah [-55 pasangan basa (bp) saking 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) nyihnayang rikala katambanin antuk MNA, paiketan Sp1 ring promotor TNFα nincap tigang kalih. Pangranjingan NFAT taler nincap lan nampekin pentingnyane (Gambar 5B). Data puniki nyihnayang indik MNA ngatur ekspresi TNFα saking transkripsi Sp1, miwah kantos akidik ekspresi NFAT.
(A) Kasaihang sareng sel T sane kabudidaya tanpa MNA, perubahan lipatan ekspresi TNFα ring sel T sane karawat antuk MNA. Pola ekspresi antuk SEM kacihnayang (n = 5 donor sane seger). Ngangganin data saking paling kidik n = 3 eksperimen independen. (B) Promotor TNFα sel T sane karawat antuk utawi tanpa MNA 8 mM sesampun NFAT lan Sp1 kagabungan sareng (Ctrl) lan stimulasi PMA/ionomisin salami 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) miwah H3 soang-soang kawigunayang pinaka kontrol negatif miwah positif ring imunopresipitasi. Kuantifikasi ChIP nyihnayang indik paiketan Sp1 lan NFAT ring promotor TNFα ring sel sane karawat antuk MNA nincap makudang-kudang kali yening saihang sareng kontrol. Ngangganin data saking paling kidik n = 3 eksperimen independen. Nilai P sane katentuang antuk makudang-kudang uji t (*** P <0,01). (C) Yening saihang sareng asma HGSC, sel T (non-sitotoksik) nyihnayang ekspresi TNF sane nincap ring tumor. Warna-warna punika nyihnayang pasien sane matiosan. Sel-sel sane kasinahang sampun kasampel acak dados 300 lan kagetar mangda prasida ngwatesin overdrawing (** Padj = 0,0076). (D) Model MNA sane kaunggahang antuk kanker ovarium. MNA kakaryanin ring sel tumor miwah fibroblas ring TME taler kaambil olih sel T. MNA nincapang paiketan Sp1 ring promotor TNFα, sané ngawinang nincap transkripsi TNFα miwah produksi sitokin TNFα. MNA taler ngawinang IFN-γ sayan rered. Inhibisi fungsi sel T ngawinang kemampuan pembunuhan sane ngidikang lan pertumbuhan tumor sane gelis.
Manut laporan, TNFα madue efek anti-tumor lan anti-tumor sane gumantung ring arep lan punggung, nanging madue peran sane sampun kaloktah ring sajeroning ngalimbakang pertumbuhan lan metastasis kanker ovarium (31-33). Manut laporan, konsentrasi TNFα ring jaringan asma lan tumor ring pasien kanker ovarium pinih tegeh yening saihang sareng jaringan jinak (34-36). Ring sajeroning mekanisme, TNFα prasida ngatur aktivasi, fungsi lan proliferasi sel darah putih, lan nguwah fenotipe sel kanker (37, 38). Konsisten sareng pikolih puniki, analisis ekspresi gen diferensial nyihnayang TNF secara signifikan kaatur ring sel T ring jaringan tumor yening saihang sareng asma (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF wantah mabukti ring populasi sel T antuk fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Cutetnyane, data puniki nukung pikayunan indik MNA madue efek imunosupresif ganda miwah ngalimbakang tumor ring HGSC.
Pelabelan fluoresen madasar antuk aliran sitometri sampun dados tata cara utama anggen malajahin metabolisme TIL. Penelitian puniki sampun nyihnayang yening saihang sareng limfosit getih perifer utawi sel T saking organ limfoid sekunder, TIL murine lan manusa madue kecenderungan sane tegehan antuk ngambil glukosa (4, 39) lan ilangnyane fungsi mitokondria secara bertahap (19, 40). Yadiastun iraga sampun nitenin pikolih sane pateh ring tetilikan puniki, panglimbak kunci inggih punika nyaihang metabolisme sel tumor lan TIL saking jaringan tumor sane kareseksi sane pateh. Konsisten sareng makudang-kudang laporan sadurungnyane puniki, sel tumor (CD45-EpCAM +) saking ascites lan tumor madue pengambilan glukosa sane tegehan saking sel CD8 + lan CD4 + T, sane ngadukung indik pengambilan glukosa sane tegeh saking sel tumor prasida kasaihang sareng sel T. Konsep persaingan sel T. TME. Nanging, aktivitas mitokondria sel tumor tegehan ring sel CD8 + T, nanging aktivitas mitokondria mesib sareng sel CD4 + T. Pikolih puniki ngukuhang tema sane medal indik metabolisme oksidatif mabuat pisan majeng ring sel tumor (41, 42). Dane taler nyihnayang indik sel CD8 + T minab dangan keni disfungsi oksidatif bandingang sel CD4 + T, utawi sel CD4 + T minab nganggen sumber karbon tiosan ring glukosa anggen miara aktivitas mitokondria (43, 44). Patut kauratiang iraga nenten nyingakin pabinayan ring pengambilan glukosa utawi aktivitas mitokondria pantaraning efektor CD4 + T, memori efektor T lan sel memori sentral T ring asma. Asapunika taler, kahanan diferensiasi sel CD8 + T ring tumor nenten wenten paiketannyane sareng pauwahan pengambilan glukosa, sane ngutamayang pabinayan sane signifikan pantaraning sel T sane kabudidayakan in vitro lan TIL manusa in vivo (22). Panyelehan puniki taler kacumpuin antuk ngawigunayang alokasi populasi sel otomatis sane nenten bias, sane salanturnyane ngungkapang indik sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + antuk pengambilan glukosa lan aktivitas mitokondria sane tegehan saking sel tumor sane prevalen nanging madue populasi sel aktif Metabolik. Populasi puniki minab pinaka subpopulasi sané katenger sel supresor mieloid utawi sel dendritik plasmasitoid sané kaidentifikasi ring analisis scRNA-seq. Yadiastun makakalih puniki sampun kalaporang ring tumor ovarium manusa [45], ipun kantun ngamerluang Pakaryan salanturnyane inggih punika nlatarang subpopulasi myeloid puniki.
Yadiastun metode madasar antuk aliran sitometri prasida nlatarang pabinayan umum ring glukosa miwah metabolisme oksidatif pantaraning soroh sel, metabolit sané pastika sané kamedalang olih glukosa utawi sumber karbon tiosan ring metabolisme mitokondria ring TME durung katentuang. Netepang wénten utawi nénten wéntennyané metabolit ring subset TIL ngamerluang pemurnian populasi sel saking jaringan sané kagetep. Punika mawinan, metode pengayaan sel iraga sane kagabungan sareng spektrometri massa prasida ngicenin wawasan indik metabolit sane kapiara secara diferensial ring sel T lan populasi sel tumor ring sampel pasien sane cocok. Yadiastun metode puniki madue keuntungan ring penyortiran sel sane kaaktifang fluoresensi, perpustakaan metabolit tertentu prasida keni ius santukan stabilitas sane melekat lan/utawi tingkat perputaran sane gelis (22). Yadiastun asapunika, metode iraga prasida ngidentifikasi kalih metabolit imunosupresif sane kauningin, adenosin lan kynurenine, santukan ipun banget mabinayan pantaraning soroh sampel.
Analisis metabonomi tumor lan subtipe TIL iraga ngicenin wawasan sane lianan indik peran metabolit ring TME ovarium. Kapertama, nganggen flow cytometry, iraga nentuang nenten wenten pabinayan ring aktivitas mitokondria pantaraning tumor lan sel CD4 + T. Nanging, analisis LC-MS/MS nyihnayang pauwahan sane signifikan ring akehnyane metabolit ring pantaraning populasi puniki, nyihnayang indik kesimpulan indik metabolisme TIL lan aktivitas metabolismenyane makasami ngamerluang interpretasi sane teliti. Kaping kalih, MNA inggih punika metabolit sane madue pabinayan sane pinih ageng pantaraning sel-sel CD45 lan sel-T ring asma, nenten tumor. Punika mawinan, kompartementalisasi miwah genah tumor minab madué panglalah sané matiosan ring metabolisme TIL, sané nyihnayang minab heterogenitas ring lingkungan mikro. Kaping tiga, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT utamanyane kawatesin ring CAF, inggih punika sel tumor kantos tingkat sane akidik, nanging kadar MNA sane prasida kadeteksi katitenin ring sel T sane mawit saking tumor. Ekspresi sane berlebihan saking NNMT ring CAF ovarium madue efek sane kauningin sane ngawinang kanker, atenganyane sangkaning ngawinang metabolisme CAF, invasi tumor lan metastasis (27). Yadiastun tingkat TIL makasami moderat, ekspresi NNMT ring CAF mapaiketan pisan sareng subtipe mesenkim Atlas Genom Kanker (TCGA), sane mapaiketan sareng prognosis sane kaon (27, 46, 47). Pamuputnyane, ekspresi enzim AOX1 sane madue tanggung jawab ring degradasi MNA taler kawatesin ring populasi CAF, sane nyihnayang sel T kirang madue kemampuan metabolisme MNA. Asil puniki nukung pikayunan yadiastun kabuatang pakaryan salanturnyane anggen ngeverifikasi pikolih puniki, MNA sane tegeh ring sel T minab nyihnayang kawentenan lingkungan mikro CAF imunosupresif.
Nyelehin saking undagan ekspresi transporter MNA sané alit miwah undagan protein kunci sané nénten prasida kadeteksi sané kasarengin ring metabolisme MNA, kawentenan MNA ring sel T nénten katenger. NNMT utawi AOX1 nenten prasida kadeteksi antuk analisis scRNA-seq lan qPCR sane kaaptiang saking kalih kohort independen. Asil puniki nyihnayang MNA nenten kasintesis olih sel T, nanging kaserep saking TME sane wenten ring sekitarnyane. Eksperimen in vitro nyihnayang indik sel T seringan mupulang MNA eksogen.
Studi in vitro iraga sampun nyihnayang inggian MNA eksogen ngawinang ekspresi TNFα ring sel T taler nincapang paiketan Sp1 ring promotor TNFα. Yadiastun TNFα madue fungsi anti tumor lan anti tumor, ring kanker ovarium, TNFα prasida ngalimbakang pertumbuhan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα ring kultur sel tumor ovarium utawi ngicalang sinyal TNFα ring model bikul prasida nincapang produksi sitokin inflamasi sane kamediasi TNFα lan ngambatang pertumbuhan tumor (32, 35). Punika mawinan, ring kasus puniki, MNA sane mawit saking TME prasida mawiguna dados metabolit pro-inflamasi malarapan antuk mekanisme sane gumantung ring TNFα malarapan antuk loop autokrin, antuk punika ngalimbakang kawentenan lan panglimbak kanker ovarium (31). Manut ring kemungkinan puniki, blokade TNFα sedek kaplajahin pinaka agen terapeutik sane potensial majeng ring kanker ovarium (37, 48, 49). Tiosan ring punika, MNA prasida ngrusak sitotoksisitas sel CAR-T ring sel tumor ovarium, ngicenin bukti salanturnyane antuk supresi imun sane kamediasi MNA. Sekadi kolektif, pikolih puniki nyihnayang model ring dije tumor miwah sel CAF ngamedalang MNA ring TME ekstraseluler. Malarapan antuk (i) stimulasi pertumbuhan kanker ovarium sane kaiusin olih TNF lan (ii) inhibisi aktivitas sitotoksik sel T sane kaiusin olih MNA, puniki minab madue efek tumor ganda (Gambar 5D).
Kesimpulannyane, antuk ngamargiang kombinasi pengayaan sel sane gelis, sekuensing sel tunggal lan profiling metabolisme, penelitian puniki nyihnayang pabinayan imunometabolomik sane ageng pantaraning tumor lan sel asma ring pasien HGSC. Analisis komprehensif puniki nyihnayang wénten pabinayan ring pengambilan glukosa miwah aktivitas mitokondria pantaraning sel T, miwah ngidentifikasi MNA pinaka metabolit pengatur imun otonom non-sel. Data puniki madue ius ring sapunapi TME ngawinang metabolisme sel T ring kanker manusa. Yadiastun persaingan langsung ring nutrisi pantaraning sel T miwah sel kanker sampun kalaporang, metabolit taler prasida dados regulator nénten langsung mangda prasida nincapang panglimbak tumor miwah minab nekes respons imun endogen. Deskripsi salanturnyane indik peran fungsional metabolit pengatur puniki prasida mukak strategi alternatif anggen nincapang respons imun anti-tumor.
Spesimen pasien lan data klinis kapolihang malarapan antuk repositori jaringan tumor kanker SM sane kasertifikasi olih Jaringan Repositori Jaringan Kanada. Manut protokol sane sampun kacumpuin olih Komite Etika Penelitian Kanker SM lan Universitas British Columbia (H07-00463), makasami spesimen pasien lan data klinis ngamolihang persetujuan tertulis sane kainfomasiang utawi secara resmi ngelepasin persetujuannyane. Sampel punika kasimpen ring BioBank sane sampun kasertifikasi (BRC-00290). Karakteristik pasien sane jangkep kacihnayang ring Tabel S1 lan S5. Antuk kriopreservasi, pisau bedah kaanggen nguraiang sampel tumor pasien antuk mekanis lan salanturnyane kadorong nglintangin filter 100 mikron mangda ngamolihang suspensi sel tunggal. Asma pasien kasentrifugasi ring 1500 rpm salami 10 menit ring suhu 4°C mangda prasida pelet sel lan ngicalang supernatan. Sel sane kapolihang saking tumor lan asma kaawet ring krio ring 50% serum AB manusa sane inaktif antuk panes (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) lan 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal sane kaawetin puniki kacair taler kawigunayang anggen metabolomik miwah nentuang metabolit sane katlatarang ring sor puniki.
Media sane jangkep kawangun antuk 0,22 μm sane kasaring 50:50 kawewehin RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Ilmiah Termo) sane kawewehin antuk serum AB manusa sane inaktif antuk panes 10% (Sigma-Aldrich), Hepes 12,5 mM (Ilmiah Termo), 2 mM l-glutamin (Ilmiah Termo) Larutan streptomisin (PenStrep) miwah 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) kawewehin antuk Hepes 20 mM (Ilmiah Termo) lan l-glutamin 2 mM (Ilmiah Termo). Penyangga pewarnaan sitometer aliran kawangun antuk saline penyangga fosfat sane kasaring 0,22μm (PBS; Invitrogen) sane kawewehin antuk serum manusa AB sane inaktif antuk panas 3% (Sigma). Penyangga pengayaan sel kawangun antuk PBS sane kasaring 0,22μm lan kawewehin antuk serum AB manusa sane inaktif antuk panas 0,5% (Sigma-Aldrich).
Ring media jangkep 37 °C, sel-sel kawarnai antuk 10 nM MT DR lan 100 μM 2-NBDG salami 30 menit. Selanturnyane, sel-sel punika kawarnai antuk pewarna viabilitas eF506 ring suhu 4°C salami 15 menit. Suspend malih sel-sel ring Blok FC (eBioscience) lan Penyangga Noda Brilian (BD Biosciences), encerkan ring penyangga pewarnaan sitometer aliran (manut pituduh pabrikan), lan inkubasi salami 10 menit ring suhu kamar. Nowarin sel antuk seperangkat antibodi (Tabel S2) ring penyangga pewarnaan sitometri aliran ring suhu 4°C salami 20 menit. Kasuspensi malih sel-sel ring penyangga pewarnaan sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sadurung kaanalisis. Anggen SpectroFlo lan FlowJo V10 anggen nyelehin data wilangan sel, lan nganggen GraphPad Prism 8 anggen ngaryanin data punika. Intensitas fluoresensi median (MFI) 2-NBDG lan MT DR kanormalisasi log, lan salanturnyane tes t mapasangan kaanggen antuk analisis statistik anggen nlatarang pasien sane cocok. Ngicalang samian populasi sane kirang saking 40 peristiwa saking analisis; ngeranjingang nilai LKM 1 antuk nilai negatif napi kemanten sadurung ngamargiang analisis statistik lan visualisasi data.
Mangda prasida nyangkepin strategi gating manual saking panel proses ring ajeng, iraga nganggen anotasi jangkep olih pohon pembatasan wangun (FAUST) (21) mangda otomatis netepang sel ring populasi sesampun ngicalang sel mati ring FlowJo. Iraga manual ngatur output anggen ngabungin populasi sane kacingak iwang kaalokasiang (ngadungang PD1+ sareng sel tumor PD1) lan populasi sane kapertahanin. Soang-soang sampel madaging rata-rata langkungan saking 2% sel, antuk akehnyane 11 populasi.
Sentrifugasi kepadatan gradien ficoll kawigunayang anggen masahang PBMC saking produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL). Sel CD8 + T kaisolasi saking PBMC nganggen CD8 MicroBeads (Miltenyi) lan kalimbakang ring media sane jangkep nganggen TransAct (Miltenyi) salami 2 minggu manut pituduh pabrikan. Sel-sel punika kagenahang 5 rahina ring media sane jangkep madaging IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), lan salanturnyane kastimulasi malih antuk TransAct. Ring rahina kaping 7, manut pituduh pabrikan, human CD45 MicroBeads (Miltenyi) kaanggen ngawi sugih sel ring tiga babak sane maundagan. Sel-sel punika kaaliquot anggen analisis aliran sitometri (sekadi sane sampun katlatarang ring ajeng), lan satus yuta sel kaaliquot ping tiga anggen analisis LC-MS/MS. Sampel sane kaproses antuk LC-MS/MS sakadi sane sampun katlatarang ring sor puniki. Iraga narka nilai metabolit sane ical antuk jumlah ion 1.000. Soang-soang sampel kanormalisasi antuk jumlah ion total (TIC), kauwah antuk logaritmik lan otomatis kanormalisasi ring MetaboAnalystR sadurung kaanalisis.
Suspensi sel tunggal saking soang-soang pasien kacair lan kasaring antuk filter 40 μm dados media sane jangkep (sekadi sane sampun katlatarang ring ajeng). Manut protokol pabrikan, tiga babak seleksi positif berturut-turut antuk pemisahan manik magnetik nganggen MicroBeads (Miltenyi) kaanggen ngawi sugih sampel antuk sel CD8+, CD4+ lan CD45- (ring es). Cutetnyane, sel-sel punika kasuspensi malih ring penyangga pengayaan sel (sekadi sane sampun katlatarang ring ajeng) lan kaitung. Sel-sel punika kainkubasi antuk manik-manik CD8 manusa, manik-manik CD4 manusa utawi manik-manik CD45 manusa (Miltenyi) ring suhu 4°C salami 15 menit, raris kacuci antuk penyangga pengayaan sel. Sampel punika kaliwatin ring kolom LS (Miltenyi), lan pecahan positif lan negatif kapupulang. Mangda prasida ngirangin durasi lan maksimalkan langkah pemulihan sel, fraksi-CD8 selanturnyane kaanggen ring babak pengayaan CD4+ kaping kalih, lan fraksi-CD4 kaanggen ring pengayaan CD45-selanturnyane. Tetep larutan ring es ring sajeroning proses pemisahan.
Anggen nyiagayang sampel anggen analisis metabolit, sel-sel kacuci apisan antuk larutan uyah dingin es, lan 1 ml metanol 80% kawewehin ring soang-soang sampel, salanturnyane kavorteks lan kabekuang ring nitrogen cair. Sampel kalaksanayang tiga siklus beku-cair lan kasentrifugasi ring 14.000 rpm salami 15 menit ring suhu 4°C. Supernatan sane madaging metabolit punika kauap kantos tuh. Metabolit kalarutang malih ring 50 μl asam formik 0,03%, kavorteks mangda prasida kacampur, raris kasentrifugasi mangda prasida ngicalang leluu.
Ekstrak metabolit sekadi sane sampun katlatarang ring ajeng. Pindahang supernatan ring botol kromatografi cair sane madue kinerja sane becik anggen penelitian metabolomik. Ngawigunayang protokol perawatan acak anggen nambanin soang-soang sampel antuk jumlah sel sane pateh mangda nenten wenten efek batch. Iraga ngamargiang penilaian kualitatif metabolit global sane sadurungnyane sampun kamedalang ring Spektrometer Massa Kuadrupol Tiga AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analisis kromatografi miwah integrasi area puncak kamargiang nganggen perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Biosistem Terapan SCIEX).
Pangitungan ion 1000 kaanggen antuk narka nilai metabolit sane ical, lan TIC saking soang-soang sampel kaanggen antuk ngitung area puncak normalisasi saking soang-soang metabolit sane kadeteksi anggen ngamecikang pauwahan sane kasobyahang olih analisis instrumental saking pemrosesan sampel. Sesampune TIC kanormalisasi, MetaboAnalystR (51) (parameter bawaan) kaanggen ring konversi logaritmik lan penskalaan garis norma otomatis. Iraga nganggen PCA antuk paket R vegan anggen ngamargiang analisis eksploratif pabinayan metabolom pantaraning soroh sampel, lan nganggen analisis redundansi parsial anggen nganalisis pasien. Ngawigunayang metode Ward anggen ngwangun dendrogram peta panas anggen ngrumpukin jarak Euclidean pantaraning sampel. Iraga ngawigunayang limma (52) ring katahnyané metabolit standar mangda prasida nyelehin metabolit sané akéh sané matiosan ring makasami soroh sel miwah lingkungan mikro. Mangda prasida ngreredang panlataran, iraga nganggen parameter rata-rata kelompok anggen nentuang model, lan nimbangin soroh sel ring lingkungan mikro pinaka soang-soang kelompok (n = 6 kelompok); antuk tes signifikansi, iraga ngamargiang tiga pangukuran berulang antuk soang-soang metabolit Mangda nenten wenten replikasi palsu, pasien ngranjing pinaka pengalang ring desain limma. Mangda prasida nyelehin pabinayan metabolit pantaraning pasien sane matiosan, iraga nyesuaiang model limma ngranjing pasien antuk cara sane tetep. Iraga nglaporang signifikansi kontras sane sampun katentuang sadurungnyane pantaraning soroh sel lan lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Risampune pengayaan kekuatan nganggen Kit Penghapusan Sel Mati Miltenyi (>80% viabilitas), sekuensing transkriptom sel tunggal kamargiang ring total asma beku idup lan sampel tumor nganggen protokol ekspresi gen 10x 5′. Limang kasus antuk tumor lan asma sane cocok kaanalisis, yadiastun viabilitas sane rendah saking asiki sampel tumor ngandegang inklusinyane. Mangda prasida ngamolihang makudang-kudang seleksi pasien, iraga ngabungin sampel soang-soang pasien ring jalur kontroler kromium 10x, lan nganalisis genah asma lan tumor secara terpisah. Sesampune ngamargiang urutan [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ujung mapasangan (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 lan 41.378 kawacen per sel antuk tumor lan asma soang-soang]], iraga nganggen CellSNP lan Vireo (53) (madasar antuk CellSNP pinaka SNP manusa umum (VCF) sane kaicenin olih GRCh38 katetapang identitas genotipe pasien status pasien ring (IBS), nenten ngranjing sel sane nenten katetapang lan sel sane kaidentifikasi dados dupleks lan donor sane cocok pantaraning asma lan sampel tumor (54 Madasar antuk tugas puniki, iraga nahanin tiga kasus antuk representasi sel sane akeh ring tumor lan asma antuk analisis hilir (scCoran pactor)6. ngasilang 6975 sel (2792 lan 4183 sel saking tumor lan asma, soang-soang) anggen analisis Iraga nganggen igraph (57) Pengelompokan Louvain saking jaringan pisaga sane pinih nampek bersama (SNN) madasar antuk jarak Jaccard ke sel-sel sane kakelompokkan antuk ekspresi manual annota. lan kavisualisasiang antuk t-SNE sel T sitotoksik katentuang olih ekspresi CD8A lan GZMA, nenten ngranjing subkluster antuk ekspresi protein ribosom sane rendah Iraga ngakses data sane katerbitang olih Izar et al (16), ngranjing penyematan t-SNE ipun, prasida ngontrol tumpang tindih ekspresi sel imun.
PBMC kapasahang saking produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) antuk sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + kaisolasi saking PBMC nganggen manik-manik CD3 (Miltenyi). Ring kawentenan utawi nenten wentennyane MNA, sel CD3+ kaaktifang antuk CD3 sane kaiket ring pelat (5μg/ml), CD28 sane larut (3μg/ml) lan IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ring rahina sane kaping untat ekspansi, viabilitas (Pewarna Viabilitas Tetap eFluor450, eBiosains) lan proliferasi (123hitung eBeads, Ilmiah Thermo Fisher) kaevaluasi antuk aliran sitometri. Evaluasi fungsi efektor antuk ngrangsang sel antuk PMA (20 ng/ml) lan ionomisin (1 μg/ml) antuk GolgiStop salami 4 jam, lan ngawasin CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend (MAb11, BD). Stimulasi sel qPCR lan ChIP antuk PMA (20 ng/ml) lan ionomisin (1μg/ml) salami 4 jam. Supernatan ELISA kapupulang sadurung lan sesampun stimulasi antuk PMA (20 ng/ml) lan ionomisin (1 μg/ml) salami 4 jam.
Sarengin protokol pabrikan antuk ngisolasi RNA nganggen RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Anggen penghancur QIA (QIAGEN) anggen ngahomogenisasi sampel. Ngawigunayang RNA sane madue kapasitas tinggi majeng ring kit cDNA (Thermo Fisher Ilmiah) anggen sintesis DNA komplementer (cDNA). Ngawigunayang Campuran Induk Lanjutan Cepat TaqMan (Thermo Fisher Scientific) anggen ngukur ekspresi gen (manut protokol pabrikan) antuk probe sekadi ring sor puniki: gliseraldehida-3-fosfat saking hidrogen (GAPDH)] miwah Hs1010726-m1 (SLC22A2). Sampel kamargiang ring sistem PCR galah nyata StepOnePlus (Biosistem Terapan) (Biosistem Terapan) ring pelat reaksi 96 sumur optik cepat MicroAmp (Biosistem Terapan) antuk film optik MicroAmp. Sakancan nilai Ct sane lintangan saking 35 kaanggep wenten ring baduur ambang batas deteksi lan kacihnayang nenten prasida kadeteksi.
Ngamargiang ChIP sakadi sane sampun katlatarang sadurungnyane (58). Cutetnyane, sel-sel punika karawat antuk formaldehida (konsentrasi pamuput 1,42%) lan kainkubasi ring suhu kamar salami 10 menit. Ngawigunayang penyangga pembengkakan sane katambahin (Hepes 25 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM lan NP-40 0,1%) ring es salami 10 menit, salanturnyane kasuspensi malih ring penyangga imunopresipitasi sekadi sane sampun katlatarang (58 ). Sampel punika raris kasonikasi antuk siklus sekadi ring sor puniki: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) lan galah statis 40 detik. Inkubasi imunoglobulin kelas ChIP G (Teknologi Pensinyalan Sel; 1 μl), histon H3 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) lan SP1 (Teknologi Pensinyalan Sel. Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) antuk sampel ring suhu 4 °C antuk ngocok alus salami 1 jam, raris nganggen manik-manik chelex (Bio-Rad) anggen ngawi sugih DNA, lan nganggen proteinase K (Thermo Fisher) anggen pencernaan protein. Promotor TNFα kadeteksi antuk PCR: maju, GGG TAT CCT TGA TGC TGT; tungkalikane, GTG CCA ACA AKTA GCC TTT ATA TG (produk 207 bp). Gambar punika kakaryanin olih Image Lab (Bio-Rad) lan kaukur nganggen piranti lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel kapupulang sekadi sane sampun katlatarang ring ajeng. Penentuan puniki kamargiang manut tata cara pabrikan kit ELISA TNFα manusa (Invitrogen), kit ELISA IL-2 manusa (Invitrogen) lan kit ELISA IFN-γ manusa (Abcam). Manut protokol pabrikan, supernatan kaencerang 1:100 anggen mendeteksi TNFα lan IL-2, lan 1:3 anggen mendeteksi IFN-γ. Ngawigunayang Pembaca Multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer) anggen ngukur daya serap ring 450 nm.
PBMC kapasahang saking produk pemisahan leukosit (Teknologi STEMCELL) antuk sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + kaisolasi saking PBMC nganggen manik-manik CD3 (Miltenyi). Ring kawentenan utawi nenten wentennyane MNA, sel CD3+ kaaktifang antuk CD3 sane kaiket ring pelat (5μg/ml), CD28 sane larut (3μg/ml) lan IL-2 (300 U/ml; Proleukin) salami 3 rahina. Sesampune 3 rahina, sel-sel punika kapupulang lan kacuci antuk saline 0,9%, lan pelet punika ka-snap frozen. Pangitungan sel kamargiang antuk aliran sitometri (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) nganggen eBeads sane kaitung 123.
Ekstrak metabolit sekadi sane sampun katlatarang ring ajeng. Ekstrak kering punika karekonstitusi ring konsentrasi 4000 ekuivalen sel/μl. Nyelehin sampel antuk kromatografi fase mabalik (1290 Infinity II, Teknologi Agilent, Santa Clara, CA) miwah kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori-pori 120-Å; #186008500). Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), inggian ionisasi elektrosemprotan mamargi antuk mode positif. Fase mobile A inggih punika 0,1% asam formik (ring H2O), fase mobile B inggih punika 90% asetonitril, 0,1% asam formik. Gradien LC inggih punika 0 ngantos 2 menit antuk 100% A, 2 ngantos 7,1 menit antuk 99% B, lan 7,1 ngantos 8 menit antuk 99% B. Raris seimbangang malih kolom antuk fase mobile A antuk laju aliran 0,6 ml/menit salami 3 menit. . Laju alirannyane 0,4ml/min, lan ruang kolom punika kapanasang ngantos 50°C. Ngawigunayang standar kimia murni MNA (M320995, Perusahaan Kimia Penelitian Toronto, York Utara, Ontario, Kanada) anggen nyantenang galah retensi (RT) lan transformasi (RT = 0,882 menit, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137, konversi→372). Rikala tetiga transisi punika mamargi ring galah retensi sane patut, transisi 1 kaanggen kuantifikasi mangda prasida mastikayang spesifisitas. Kurva standar MNA (Perusahaan Kimia Penelitian Toronto) kapolihang antuk nem pengenceran seri larutan saham (1 mg/ml) mangda ngamolihang standar 0,1, 1,0, 10 lan 100 ng/ml lan 1,0 lan 10 μg/ml cairan soang-soang. Wates deteksi inggih punika 1 ng/ml, lan respons linier inggih punika pantaraning 10 ng/ml lan 10μg/ml. Soang-soang suntikan kalih mikroliter sampel lan standar kaanggen analisis LC/MS, lan sampel kontrol kualitas campuran kalaksanayang nyabran kutus suntikan mangda prasida mastikayang stabilitas platform analisis. Respons MNA saking samian sampel sel sane karawat antuk MNA wenten ring kisaran linier assay. Panyelehan data kamargiang nganggen piranti lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruksi αFR-CAR generasi kaping kalih kaambil saking Song dkk. (59). Cutetnyane, konstruksi madaging daging sekadi puniki: Undagan pemimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal spesifik αFR manusa, engsel CD8a miwah genah transmembran, domain intraseluler CD27 miwah domain intraseluler CD3z. Undagan CAR sane jangkep kasintesis olih GenScript, taler raris kakloning ring vector ekspresi lentivirus generasi kaping kalih ring hulu kaset ekspresi GFP sane kawigunayang anggen nitenin panglimbak transduksi.
Lentivirus puniki kakaryanin antuk transfeksi sel HEK293T [Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC); tumbuh ring media Elang sane kauwah olih Dulbecco sane madaging 10% serum sapi janin (FBS) lan 1% PenStrep, lan nganggen vektor CAR-GFP lan Plasmid kemasan (pspax2 lan pMD2.G, Addgene) nganggen amina lipofeksi (Sigma-Aldrich). Supernatan sane madaging virus kapupulang 48 lan 72 jam sesampun transfeksi, kasaring, lan kakonsentrasiang antuk ultrasentrifugasi. Simpen supernatan virus sane sampun kakonsentrasi ring suhu -80°C kantos transduksi.
PBMC kapasahang saking produk pemisahan leukosit donor sane seger (Teknologi STEMCELL) antuk sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Ngawigunayang mikromanik CD8 seleksi positif (Miltenyi) anggen ngisolasi sel CD8+ saking PBMC. Merangsang sel T antuk TransAct (Miltenyi) lan ring media TexMACS [Miltenyi; kawewehin antuk 3% serum manusa sane nenten kaaktifang antuk panes, 1% PenStrep lan IL-2 (300 U/ml)]. jam sesampun stimulasi, sel T katransduksi antuk lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 kantos 3 rahina risampune transduksi ring Cytek Aurora (ring FSC (Hamburan Maju)/SSC (Hamburan Samping), Singlet, GFP+), evaluasi ekspresi GFP sel anggen nyihnayang efisiensi transduksi sane paling kidik 30% .
Sel CAR-T kapanakang salami 24 jam ring Immunocult (Teknologi STEMCELL; kawewehin antuk 1% PenStrep) ring kahanan sekadi puniki: nenten karawat, karawat antuk adenosin 250 μM utawi MNA 10 mM. Sesampune praperawatan, sel CAR-T kacuci antuk PBS lan kagabungan sareng 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; ring media McCoy 5A (Sigma-Aldrich) sane kawewehin antuk 10% FBS lan 1% PenStrep ring 10: Rasio efektor majeng ring sasaran 1 kakuatin ring tigang lembar ring media Imunokult sane kawewehin. Sel SK-OV-3 lan sel SK-OV-3 sane kalisis antuk saponin digitalis (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) kaanggen pinaka kontrol negatif lan positif, soang-soang. Sesampune 24 jam ko-kultivasi, supernatan kapupulang lan laktat dehidrogenase (LDH) kaukur manut pituduh pabrikan (LDH Glo Sitotoksisitas Assay Kit, Promega). Supernatan LDH kaencerang 1:50 ring penyangga LDH. Persentase pembunuhan kaukur nganggen rumus sekadi ring sor puniki: persentase pembunuhan = persentase koreksi / tingkat pembunuhan maksimum x 100%, ring dija persentase koreksi = ko-kultur-sel T kemanten, lan tingkat pembunuhan maksimum = kontrol positif-kontrol negatif.
Sakadi sane sampun katlatarang ring teks utawi materi lan metode, nganggen GraphPad Prism 8, Microsoft Excel utawi R v3.6.0 anggen analisis statistik. Yening makudang-kudang sampel kapupulang saking pasien sane pateh (sekadi asma lan tumor), iraga nganggen tes t mapasangan utawi ngranjingang pasien pinaka efek acak ring model linier utawi umum manut sane patut. Antuk analisis metabolomik, tes kepentingan kamargiang antuk tigang lembar.
Antuk materi paweweh ring artikel puniki, durusang cingakin ring http://advances.sciencemag.org/cgi/isi/lengkap/7/4/eabe1174/DC1.
Puniki wantah artikel akses terbuka sane kasobyahang manut ring ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, sane ngicenin kawigunan, distribusi lan reproduksi ring media napi manten, asalkan kawigunan pamuput nenten kaanggen pikolih komersial lan premisnyane inggih punika karya aslinyane patut. Reperensi.
Catetan: Google wantah nunas mangda Sameton ngicénin alamat email mangda jadma sané kaanjurang ring laman punika uning yéning Sameton meled nyingakin email punika lan email punika nénten spam. Google nénten pacang ngambil alamat email napi-napi.
Pitakén puniki kaanggén nguji napiké Sameton dados pengunjung lan nyegah pengiriman spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusel G. Jones), Pineas T. Hamilton (Pineas T.
MNA prasida nagingin penindasan imun sel T taler pinaka sasaran imunoterapi sane becik anggen nambanin kanker manusa.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusel G. Jones), Pineas T. Hamilton (Pineas T.
MNA prasida nagingin penindasan imun sel T taler pinaka sasaran imunoterapi sane becik anggen nambanin kanker manusa.
©2021 Asosiasi Amerika antuk Panglimbak Ilmu Pengetahuan. samian hak sampun kacawis. AAAS inggih punika mitra saking HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, Ref Lintas miwah PENGHITUNG. Kemajuan Ilmu Pengetahuan ISSN 2375-2548.